郭文芬，謝作樺，王愛貴

1.江西省藥品認(rèn)證審評中心，江西 南昌 330002；2.江西德上醫(yī)藥研究院有限公司，江西 樟樹 331208；3.江西德上制藥股份有限公司，江西 樟樹 331208

黃柏片由黃柏稠膏和黃柏細(xì)粉混合而制成的片劑型中成藥，具有清熱、除濕，瀉火、解毒的功效。主要用于治療除濕熱、瀉火，除黃疸，帶下，盜汗，遺精等［1-2］。為了進(jìn)一步了解黃柏片的藥品質(zhì)量水平，依據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則和黃柏片的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］，擬定黃柏片微生物限度檢查方法，并進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)建立的黃柏片的微生物檢查方法的適用性和準(zhǔn)確性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSC-1000A2 生物安全柜（上海博迅實(shí)業(yè)），XY600-2C 電子天平（常州市幸運(yùn)電子），YXQLS-50SII 立式滅菌壓力鍋（上海博迅醫(yī)療），SWCJ-IFD 單人凈化工作臺（上海博迅醫(yī)療），BMJ-160C 霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)），SHP-150 生化培養(yǎng)箱（上海培因?qū)嶒?yàn)儀器）。

1.2 材料

試藥：pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號1903152）。菌種：金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，大腸埃希菌CMCC（B）44102，均來源于中國食品藥品檢定研究院，所使用菌株均為第三代。培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號190711），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號190816），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號200813），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號1903152），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號190311）均來源于廣東環(huán)凱。樣品：黃柏片（江西德上制藥股份有限公司，批號：19100101、20090202、20100201，規(guī)格：0.4 g/片）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌懸液準(zhǔn)備

依照《中國藥典》2020年版四部通則1105、1106檢查項(xiàng)中方法［2］，將各試驗(yàn)菌制成適宜濃度的菌懸液。

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 供試液制備 取黃柏片，研細(xì)，稱取10 g，加入100 mL pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制成（1:10）濃度的樣品，搖勻，制成供試液。

2.2.2 測定方法 平皿法：取供試液（1 mL/皿），其中2 個(gè)平皿立即傾注15 mL 溫度不超過45 ℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基混勻，另2 個(gè)注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基搖勻，將以上平皿分別置35 ℃和25 ℃培養(yǎng)，需氧菌培養(yǎng)不超過5 d，霉菌及酵母菌培養(yǎng)不超過7 d，在5 d 和7 d 分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.2.3 回收比值測定 試驗(yàn)組：取供試液各9.9 mL，加入0.1 mL 五種菌懸液（濃度小于100 cfu/mL），搖勻，吸取1 mL，轉(zhuǎn)移至平皿中，每個(gè)樣品2 個(gè)平皿，倒入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，大約15 mL，搖勻，凝固，分別倒置在35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d和25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。供試品對照組：稀釋液代替菌液，其他操作同試驗(yàn)組。菌液對照組：稀釋液代替供試液，其他操作同試驗(yàn)組。陰性對照：培養(yǎng)基代替供試液與菌液，其他操作同試驗(yàn)組。

2.2.4 回收比值測定 計(jì)算公式為：回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)。計(jì)算結(jié)果見表1 與表2，可知，回收比值約在0.5～2.0 范圍，可采用平皿法檢查需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)［3］。

表1 需氧菌總數(shù)回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn) 試驗(yàn)組：將9.9 mL 供試液和0.1 mL 的大腸埃希菌懸液加入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL 中，搖勻，35 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL 培養(yǎng)物加入到100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基，搖勻，44 ℃培養(yǎng)48 h，取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平皿，劃線取麥康凱液體培養(yǎng)物接種，35 ℃培養(yǎng) 72 h。菌液對照組：稀釋液代替供試液，其他同試驗(yàn)組。供試品對照組：稀釋液代替菌液，其他同試驗(yàn)組。陰性對照組：稀釋液替代供試液與菌液，其他同試驗(yàn)組。檢查結(jié)果見表3，產(chǎn)品無抑菌干擾，大腸埃希菌能正常檢出，可采用常規(guī)法檢查控制菌大腸埃希菌［4］。

表3 大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

2.3.2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查 試驗(yàn)組：取供試液到兩支試管，約9.9 mL，分別加入0.1 mL 大腸埃希菌菌液和0.1 mL 銅綠假單胞菌菌液，搖勻，在25 ℃培養(yǎng)約2 h。取預(yù)培養(yǎng)物分別接種到9 mL 的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，取樣數(shù)量約相當(dāng)于0.1 g，0.01 g，0.001 g 的供試品，35 ℃培養(yǎng)48 h，取紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿，劃線接種新鮮培養(yǎng)物，35 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落生長情況。菌液對照組：釋液代替供試液，其他同試驗(yàn)組。供試品對照組：稀釋液代替菌液，其他同試驗(yàn)組。陰性對照組：稀釋液替代供試液與菌液，其他同試驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見表4，產(chǎn)品無抑菌干擾，耐膽鹽革蘭陰性菌能正常檢出，可采用該法檢查控制菌耐膽鹽革蘭陰性菌［5］。

表4 耐膽鹽革蘭陰性菌計(jì)數(shù)法驗(yàn)證結(jié)果（cfu）

2.3.3 沙門菌檢查 試驗(yàn)組：取90 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，加入供試液9.9 mL 和0.1 mL 沙門菌懸液，35 ℃培養(yǎng)24 h。取兩支試管，加入10 mLRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，接種0.1 mL 新鮮培養(yǎng)物，35 ℃培養(yǎng)24 h。木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基瓊脂平皿，取少量新鮮培養(yǎng)物劃線接種，35 ℃培養(yǎng)48 h，取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面，進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，使用接種針挑選的疑似菌落，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。菌液對照組：釋液代替供試液，其他同試驗(yàn)組。供試品對照組：稀釋液代替菌液，其他同試驗(yàn)組。陰性對照組：稀釋液替代供試液與菌液，其他同試驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見表5，采用常規(guī)法，沙門菌能正常檢出，陰性對照顯示無干擾，可采用常規(guī)法檢查控制菌沙門菌［6］。

表5 沙門菌驗(yàn)證結(jié)果

2.4 樣品微生物限度檢查［7-8］

采用上述方法對三批黃柏片的微生物限度進(jìn)行需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查，檢查結(jié)果見表6，結(jié)果表明，建立的方法可以應(yīng)用于產(chǎn)品微生物限度檢查。

表6 3 批樣品微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

驗(yàn)證結(jié)果表明，根據(jù)《中國藥典》2020年版四部的檢查法要求，對黃柏片的微生物限度的檢驗(yàn)方法的常規(guī)法在2015年版基礎(chǔ)上，進(jìn)一步確認(rèn)，使用常規(guī)檢驗(yàn)方法可以保證黃柏片的微生物檢查法的安全性和有效性［9］。在黃柏片的生產(chǎn)工藝發(fā)生變更時(shí)，檢驗(yàn)方法發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)重新對方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證［10］。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，各種陽性對照菌的回收比值均在 0.5～2.0 的范圍內(nèi)，常規(guī)法檢查控制菌，實(shí)驗(yàn)條件下無抑菌作用［11］。因此，可采用平皿法檢查黃柏片的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)和常規(guī)法檢查控制菌［12］。