鄭偉，黨珊，張智勇，萬永，劉司南，?；⒘?/p>

（陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068，1.肝膽外科，2.老年消化科；3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710061）

近年來，由對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）的不當使用所致的重度肝損傷、肝衰竭在臨床上呈上升趨勢[1]。如何減輕以APAP為代表的急性藥物性肝損傷是現(xiàn)階段肝臟損傷控制領域的研究熱點。遠端缺血預處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）即通過對一個組織或器官進行一次或數(shù)次非致命性的缺血再灌注處理，可以保護一個遠隔器官免受致命性的缺血再灌注損傷[2]。目前已證實，RIPC可緩解肝臟缺血再灌注損傷，保護肝移植受體術后肝功能[3]。但RIPC對于APAP誘導的藥物性肝損傷是否有效，鮮有報道。本研究旨在通過構(gòu)建APAP誘導的小鼠藥物性肝損傷模型，觀察RIPC對模型小鼠肝功能、氧化應激水平、炎癥因子水平、組織病理學方面的影響，探討可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

6～8周齡、體質(zhì)量22～25 g的C57BL/6雄性小鼠，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供[許可證號：SYXK（陜）2016-006]。血紅素加氧酶-1（HO-1）抗體，美國Abcam公司。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）、核因子E2相關因子2（Nrf2）抗體，美國Santa Cruz公司。血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與白介素-6（IL-6）檢測試劑盒，深圳達科為生物技術有限公司。谷胱甘肽酶（GSH）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒和丙二醛（MDA）測試盒，南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液，上海碧云天生物技術有限公司。APAP溶液的配制：將0.6 g APAP粉劑溶于100 mL生理鹽水中，在40 ℃水浴鍋中晃動充分溶解、混勻，按300 mg/kg即50 mL/kg的劑量給藥準備，每只小鼠約20 g，平均給藥劑量約1 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和模型制作

實驗分組：40 只BALB/c雄性小鼠按隨機數(shù)字表法平均分為4組：（1）空白對照組（C組，不做任何處理）；（2）假手術組（S組，小鼠遠端缺血預處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL生理鹽水）；（3）肝損傷組（A組，腹腔注射1 mL APAP溶液）；（4）遠端缺血預處理組（R組，小鼠遠端缺血預處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL APAP溶液）。各組小鼠均在處理后16 h后摘眼取血，脫頸處死后獲取肝組織樣本。

模型制作：（1）首先麻醉小鼠，將25 mg氯胺酮和2.5 mL甲苯噻嗪混合比例配制好麻醉藥，每只小鼠腹腔注射（5 mL/kg）。（2）遠端缺血預處理：于小鼠的右后肢中上部，取無彈性棉質(zhì)繩帶捆綁結(jié)扎5 min造成肢體缺血后，再松開繩帶，讓血液再灌注5 min；重復上述操作4 個循環(huán)，完成造模。通過足部顏色及下肢股動脈搏動情況來顯示血液流動情況，評價遠端局部缺血的效果。（3）S組為遠端缺血預處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL生理鹽水。R組為遠端缺血預處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL APAP溶液。

1.2.2 血清ALT、AST、TNF-a、IL-6水平的測定：根據(jù)檢測試劑盒說明書，進行相關指標的測定。

1.2.3 肝臟活性氧（ROS）含量檢測：取出分離后的肝臟組織制作冰凍切片，根據(jù)DHE-ROS活性氧檢測試劑盒說明書行熒光定性分析，藍色熒光為細胞核，紅色熒光為ROS陽性表達。

1.2.4 氧化應激程度的測定：根據(jù)檢測試劑盒說明書指示，測定肝組織MDA、GSH、SOD含量。

1.2.5 Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的測定：根據(jù)RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿，肝組織與RIPA裂解液的比例為1 mg∶7.5 μL，用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解25 min后，以12 000 r/min離心20 min，離心半徑7 cm，取上清，利用Western blotting檢測各組小鼠肝組織Keap1、Nrf2和HO-1表達的變化，應用β-actin作為內(nèi)參校正。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清ALT、AST水平變化

與C組血清ALT[（87.85±9.19）U/L]和AST[（50.93±11.94）U/L]、S組血清ALT[（88.26±3.58）U/L]和AST[（51.88±10.94）U/L]比較，A組血清[ALT（5 643.20±688.21）]U/L、AST[（4 479.10±834.46）U/L]水平和R組血清[ALT（3 730.12±599.33）U/L]、AST[（3 592.52±646.13）U/L]水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；R組血清ALT和AST水平低于A組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。具體見圖1。

圖1 RIPC對APAP誘導急性藥物性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平的影響

2.2 血清TNF-α、IL-6水平變化

與C組血清TNF-α[（43.98±5.66）pg/mL]和IL-6[（71.55±9.74）pg/mL]、S組血清TNF-α[（47.80±9.54）pg/mL]和IL-6[（73.88±8.66）pg/mL]比較，A組血清TNF-α[（337.75±48.57）pg/mL]和IL-6[（938.03±160.90）pg/mL]水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；R組血清TNF-α[（235.55±65.77）pg/mL]和IL-6[（713.48±87.78）pg/mL]水平明顯高于C組和S組，低于A組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。具體見圖2。

圖2 RIPC對APAP誘導急性藥物性肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響

2.3 肝臟ROS含量變化

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與C組和S組對比，A組可見較多紅色熒光，ROS產(chǎn)生較多。與A組相比，R組紅色熒光明顯減少，ROS產(chǎn)生減少。具體見圖3。

圖3 RIPC對APAP誘導急性藥物性肝損傷小鼠肝組織ROS的影響（×200）

2.4 肝組織GSH、SOD水平變化

與C組肝組織GSH[（14.30±1.21）mg/g protein]和SOD[（17.06±1.64）U/mg protein]、S組肝組織GSH[（14.19±2.96）mg/g protein]和SOD[（18.27±1.58）U/mg protein]比較，A組肝組織GSH[（7.13±0.89）mg/g protein]和SOD[（8.15±0.65）U/mg protein]活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；R組肝組織GSH[（10.36±0.96）mg/g protein]和SOD[（11.14±1.61）U/mg protein]活性較A組明顯升高，但仍低于C組和S組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。具體見圖4。

圖4 RIPC對APAP誘導急性藥物性肝損傷小鼠肝組織GSH、SOD活性的影響

2.5 肝組織MDA水平變化

與C組肝組織MDA[（2.88±0.87）nmol/g protein]和S組肝組織MDA[（2.70±0.59）nmol/g protein]比較，A組肝組織MDA[（13.20±1.94）nmol/g protein]含量增高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；R組肝組織MDA[（8.50±0.82）nmol/g protein]活性較C組和S組明顯上升，較A組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。具體見圖5。

圖5 RIPC對APAP誘導急性藥物性肝損傷小鼠肝組織MDA含量的影響

2.6 肝組織Keap1、Nrf2和HO-1表達變化

A組肝臟Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達量分別為0.75±0.06、0.56±0.04和0.85±0.07，顯著低于C組的1.08±0.09、1.06±0.12和1.07±0.14，以及S組的1.19±0.22、1.16±0.32和1.22±0.24，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。R組肝組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達量分別為1.47±0.26、1.94±0.22和1.66±0.18，較前三組均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。如圖6所示。

圖6 RIPC對APAP誘導急性藥物性肝損傷小鼠Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

3 討論

因APAP濫用而導致的急性肝損傷逐年上升，已成為歐美國家急性肝衰竭的首要病因[4]。隨著近年來加速康復外科理念在國內(nèi)的廣泛推進，APAP等非甾體類藥物在圍術期疼痛管理中的應用也越來越廣泛[5]。APAP不破壞胃黏膜，對血小板功能也不產(chǎn)生影響，但其潛在的肝損傷、腎損傷等相關不良事件日益受到關注[6]，引發(fā)了研究人員對非甾體類藥物安全性的擔憂。對以APAP為代表的藥物性肝損傷，目前仍缺乏特異性的治療手段，病情嚴重的患者往往需要進行血液灌流、血液透析以及大劑量保肝利膽藥物的應用，必要時還需要進行肝移植。對于如何預防和治療APAP源性肝損傷已逐漸成為目前國內(nèi)外研究的熱點。

缺血預處理最早由Murry等[7]于1986 年提出，后經(jīng)Przyklenk等[8]的改進，1993年正式提出RIPC的概念。研究人員發(fā)現(xiàn)，對冠狀動脈旋支進行短暫的缺血再灌注可以顯著減少冠脈左前降支阻塞引起的心肌梗死面積。在肝損傷方面，Zoltán等[9]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，RIPC可顯著緩解肝臟缺血再灌注損傷。Jung等[3]發(fā)現(xiàn)，在肢體遠端行袖帶加壓來實現(xiàn)RIPC可顯著降低肝移植受體術后肝功能的異常增高。RIPC發(fā)揮保護作用的機制十分復雜，有研究認為可能是通過體液通路、神經(jīng)通路及機體系統(tǒng)性的應答來實現(xiàn)的[10]。

本研究以APAP誘導的肝損傷小鼠為模型，分別從肝功能水平、氧化應激程度、炎癥因子水平等方面進行研究，并探討RIPC有效減輕APAP藥物性肝損傷的可能途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APAP可導致小鼠肝內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，抑制抗氧化酶GSH、SOD的活性，造成機體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的異常堆積，釋放TNF-α和IL-6 等炎性因子。而通過對APAP肝損傷小鼠進行遠端缺血預處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIPC可以顯著改善小鼠血清ALT、AST水平，起到明顯的保護肝臟的作用。此外，我們通過ELISA檢測血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過RIPC處理后，小鼠的炎癥因子水平顯著降低，說明RIPC可減輕APAP導致的藥物性肝損傷的炎癥過程及炎性因子的釋放。而對氧化應激產(chǎn)物ROS、MDA和抗氧化系統(tǒng)主要酶類GSH和SOD的檢測發(fā)現(xiàn)，在RIPC的作用下，ROS含量、MDA水平明顯降低，脂質(zhì)過氧化程度減輕，抗氧化物質(zhì)GSH、SOD的消耗也明顯減少，證明RIPC可通過減輕氧化應激過程，減少體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的消耗，對藥物性肝損傷發(fā)揮保護性作用。對于上述改變，本研究通過Western blotting初步發(fā)現(xiàn)RIPC對APAP肝損傷的上述保護作用有Keap1、Nrf2和HO-1的參與。

Keap1-Nrf2信號通路由于可抵抗內(nèi)外界氧化和化學物質(zhì)等刺激導致的氧化應激反應，在機體應對各種外來損傷的防御中起著非常重要的作用，是機體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[11]。生理狀態(tài)下，Keap1與Nrf2相結(jié)合存在于包漿中，當細胞受到活性氧（ROS）等刺激后，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，活化的Nrf2 轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，激活其下游包括HO-1 在內(nèi)的多種靶蛋白的表達來調(diào)節(jié)機體內(nèi)氧化還原平衡，使機體恢復到正常的生理狀態(tài)[12]。HO-1作為血紅素降解的限速酶，其廣泛分布于哺乳動物的多種組織細胞中，可由多種刺激因子誘導表達，如氧化應激、內(nèi)毒素等[13]。HO-1的激活，可明顯抑制氧化應激反應、炎癥反應和腫瘤的生長[14]，現(xiàn)有研究證實其在APAP肝損傷中具有保護作用[15]。本研究中，Western blotting結(jié)果顯示Keap1、Nrf2和HO-1在A組中的蛋白相對表達量明顯低于S組和C組，在R組中明顯回升，說明Keap1、Nrf2和HO-1分子很可能參與了RIPC的保護機制。

綜上所述，RIPC可通過減輕氧化應激和炎癥反應對急性藥物性肝損傷發(fā)揮保護作用。RIPC在臨床中具有便捷易操作的巨大優(yōu)勢，其發(fā)揮肝臟保護功能的調(diào)控機制值得未來進一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突。