彭韻潔，陳麗娜，楊明，王奇，時東方，王晶，劉春明

（長春師范大學(xué)中心實驗室，吉林 長春 130032）

植物生長調(diào)節(jié)劑（plant growth regulator，PGR）是從外部施加給植物，顯著改變植物生長發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)[1]，目前已廣泛應(yīng)用于中藥材的種植栽培。與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)相比，植物生長調(diào)節(jié)劑具有高效、低毒的特性，在促產(chǎn)增量、改質(zhì)抗逆等方面發(fā)揮了重要的作用[2]。但使用不合理仍會導(dǎo)致其在中藥材里殘留，存在降低中藥材活性成分含量和危害食用者健康的風(fēng)險。如丁酰肼的水解產(chǎn)物非對稱二甲基聯(lián)氨具有致畸、致癌的危害[3]；乙烯利過量食用后會加速衰老，腐蝕消化道，造成消化道潰瘍[4]；赤霉素會影響機(jī)體新陳代謝和內(nèi)分泌系統(tǒng)等[5]。GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了食品類產(chǎn)品中22種植物生長調(diào)節(jié)劑的最大殘留限量[6]，目前中藥材中植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留限量與檢測標(biāo)準(zhǔn)尚不明確，因此該標(biāo)準(zhǔn)的建立具有緊迫性和必要性。

中藥材人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖，人參（人工種植）于2012年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品。人參作為日常補(bǔ)品已融入人們的日常生活，如時下盛行的“人參養(yǎng)榮湯”、“人參黃精正氣茶”、“人參糕”、“參雞湯”等已被人們廣泛使用[7-8]。但由于人參的生長周期長，且根芽和種子均具有休眠特性[9]，在種植過程中人們往往會使用大量的植物生長調(diào)節(jié)劑促使其打破休眠，快速生長。近年來，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測蔬菜、水果及糧油產(chǎn)品中植物生長調(diào)節(jié)劑報道較多[10-13]，但檢測人參中植物生長調(diào)節(jié)劑的報道較少。宋志峰等[14]研究了人參中4種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留，其中涉及的PGR種類較少，且覆蓋面窄。本試驗采用QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS的方法分析了人參中19種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留狀況，并基于攝入風(fēng)險，對檢測結(jié)果呈陽性的物質(zhì)進(jìn)行了膳食暴露評估，以期為植物生長調(diào)節(jié)劑在人參生產(chǎn)中的科學(xué)使用及食用安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試驗試劑

1.1.1.1 供試品

人參樣品：長白山各人參種植基地，共12批樣品。

1.1.1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher Science公司；甲酸（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18、石墨化碳黑（graphitized carbon，GCB）：美國 Sigma 公司；0.22 μm有機(jī)系濾膜：天津美瑞泰克公司；無水硫酸鎂（分析純）：北京化工廠；氯化鈉、甲酸銨（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.1.3 植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品

甲醇中丁酰肼、甲醇中氯吡脲、甲醇中噻苯隆脫葉靈、甲苯中氯苯胺靈、丙酮中胺鮮脂、乙腈中赤霉素、甲醇中6-芐基腺嘌呤、異丙醇中矮壯素、甲苯中多效唑、正己烷中烯效唑（濃度為1 mg/mL）：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；萘乙酸（純度≥99.9%）、氯化膽堿（純度≥99%）、吲哚-3-乙酸（純度≥99.9%）、吲哚-3-丁酸（純度≥99.9%）、5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉（純度≥99.9%）、4-氯苯氧乙酸（純度≥99.9%）、6-糠氨基嘌呤（純度≥99.9%）、異戊烯腺嘌呤（純度≥99.9%）、反玉米素（純度≥99.9%）、氘代莠去津（純度≥99.5%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.1.2 試驗儀器

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Acquity Xevo TQ-S）：美國Waters公司；高速冷凍離心機(jī)（3-30K）：美國Sigma公司；實驗室純水制備系統(tǒng)（Milli-Q Integral 3）：美國 Millipor公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.01%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件：0～2 min（95%A→90%A），2 min～5 min（90%A→50%A），5 min～8 min（50%A→25%A），8 min～9 min（25%A→5%A），9 min～10 min（5%A→95%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5.0 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

試驗采用電噴霧離子源，正負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（multi-reaction monitoring mode，MRM），其離子源參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓1.00 kV，源內(nèi)碰撞解離電壓50 V，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流速700 L/h，霧化氣壓強(qiáng)7.0 bar（1 bar＝100 000 Pa），碰撞氣流速0.15 mL/min，離子源溫度150℃。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取氯化膽堿、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸、5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、4-氯苯氧乙酸、6-糠氨基嘌呤、異戊烯腺嘌呤、反玉米素標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg分別于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 μg/mL的儲備液，其余11種植物生長調(diào)節(jié)劑為1 mg/mL的液體標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取內(nèi)標(biāo)化合物氘代莠去津10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備溶液。上述儲備液均置于-20℃冰箱中保存。

分別準(zhǔn)確量取一定體積的上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇定容至10 mL，配制噻苯隆、4-氯苯氧乙酸、氯吡脲、氯苯胺靈濃度為10 μg/mL，5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、異戊烯腺嘌呤、赤霉素、6-芐基腺嘌呤、氯化膽堿、矮壯素、丁酰肼、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、反玉米素、萘乙酸濃度為1 μg/mL，烯效唑、多效唑、胺鮮酯、6-糠氨基嘌呤濃度為0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。

1.2.4 供試品溶液的制備

精確稱取樣品粉末2 g（過3號篩），置50 mL聚苯乙烯離心管中，加入5 mL超純水，渦旋混勻后靜置1 h，加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈，置振蕩器上（500次/min）劇烈振蕩2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉混合物，立即搖散，置振蕩器上劇烈振蕩2 min，于4℃下4 000 r/min離心10 min，吸取上層乙腈提取液2 mL置15 mL聚丙烯離心管中，30℃下氮吹濃縮至干，用乙腈和水（1∶9，體積比）定容 1 mL，渦旋混勻，過 0.22 μm 微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測定，并視情況進(jìn)一步稀釋。

1.2.5 樣品分析

按1.2.4中方法制備12批人參的供試品溶液，按色譜質(zhì)譜條件測定，采用內(nèi)標(biāo)法計算人參中檢測顯陽性的植物生長調(diào)節(jié)劑的含量。每批樣品平行2份，每份溶液進(jìn)樣3次。

1.2.6 膳食暴露評估

1.2.6.1 人參中各植物生長調(diào)節(jié)劑的單一危害

參照文獻(xiàn)[15]中的評估方法，計算各化合物的危害商（hazard quotient，HQ），當(dāng) HQ＞1時，則表明膳食暴露風(fēng)險較大，反之當(dāng)HQ＜1時，則表明膳食暴露風(fēng)險較低。HQ的計算方法如下。

式中：殘留量為人參中檢測出的PGR含量，mg/kg；平均膳食量參照2020版《中國藥典》的規(guī)定，人參日均食用量在3 g～9 g，本研究按5 g/d計算；平均體重按60 kg計算；每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）參照GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中的規(guī)定，mg/kg bw。

1.2.6.2 人參中各植物生長調(diào)節(jié)劑的總危害

采用各化合物的危害指數(shù)（hazard index，HI）進(jìn)行評估，該方法簡單快速，多用于初級的累積風(fēng)險評估。當(dāng)HI＜1時，表明總的膳食暴露風(fēng)險較低；當(dāng)HI＞1時，則表明總的膳食暴露風(fēng)險較大，這時則需推算出具有累積效應(yīng)的物質(zhì)基于共同作用終點(diǎn)的參考值，從而計算出相應(yīng)的HI，然后再進(jìn)行比較。具體計算方法如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的選擇

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗分別以乙腈、甲醇作為有機(jī)相，不同濃度甲酸銨、甲酸作為添加劑，對洗脫體系進(jìn)行了考察，并進(jìn)一步優(yōu)化洗脫梯度，從而確定最佳洗脫條件。各化合物的提取離子流圖見圖1。

結(jié)果表明，當(dāng)乙腈作為流動相時，基線噪音較低、峰形較好且響應(yīng)值增高。同時大多數(shù)化合物在5mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸溶液、0.01%的甲酸水溶液中分離較好且信號穩(wěn)定。氯苯胺靈在甲酸銨溶液作為流動相時信號低，峰形差，但在0.01%的甲酸水溶液中響應(yīng)度增強(qiáng)，且峰形得到了改善。以優(yōu)先考慮受流動相影響較大的氯苯胺靈為原則，結(jié)合化合物整體分離度、離子靈敏度等因素，最終確定以乙腈-0.01%甲酸水溶液作為流動相，并采用1.2.1中梯度洗脫方式進(jìn)行洗脫。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗分別將200 ng/mL 19種PGR單一標(biāo)準(zhǔn)溶液通過針泵引入質(zhì)譜系統(tǒng)，在電噴霧電離源（electro spray ionization，ESI）正負(fù)離子同時掃描的情況下尋找母離子，并對母離子進(jìn)行子離子掃描和碰撞能優(yōu)化，從而得到質(zhì)譜分析參數(shù)，19種化合物的優(yōu)化結(jié)果如表1所示。

表1 19種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters for 19 plant growth regulators

結(jié)果表明不同的化合物之間結(jié)構(gòu)差異較大，電離行為也有所不同，11種化合物在正離子模式下靈敏度較高、穩(wěn)定性較好，8種化合物在負(fù)離子模式下有較好的靈敏度和穩(wěn)定性。在兩個子離子中，靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的子離子為定量離子，次之的為定性離子。

2.1.3 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS方法常用的凈化材料有 C18、PSA、GCB，為了明確凈化材料對目標(biāo)待測物的影響，本試驗對每種凈化材料分別單獨(dú)進(jìn)行考察。結(jié)果表明PSA對極性較大的化合物如丁酰肼、矮壯素的吸附程度高，GCB對平面結(jié)構(gòu)化合物如4-氯苯氧乙酸、氯吡脲的回收率影響較大，C18主要吸附極性較弱的脂肪酸、烯烴類及甾醇等基質(zhì)干擾。相比較之下C18的凈化效果優(yōu)于前兩者，但回收率為80%～120%的化合物只有12種，且氯吡脲回收率幾乎為0，仍不能滿足分析需要。而未凈化提取液的回收率均在75%以上，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗采取不凈化措施，提取后直接進(jìn)樣檢測。這與劉佳銘等[16]和Sutcharitchan等[17]的研究結(jié)果一致。試驗表明，由于串聯(lián)質(zhì)譜具有極高的專屬性和靈敏度，可以從復(fù)雜基質(zhì)中有效地檢測出待測成分，滿足分析需要。但采用此種方法后續(xù)一定要定期檢查色譜柱適用性，加強(qiáng)儀器設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)。

圖1 19種植物生長調(diào)節(jié)劑的定量離子色譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatogram of 19 plant growth regulators

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是指除被分析物以外的樣品中其他組分對分析物的干擾，基質(zhì)效應(yīng)普遍存在痕量分析的物質(zhì)中，常常會影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)基質(zhì)成分對目標(biāo)化合物響應(yīng)強(qiáng)度的不同影響，可分為基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。本試驗采用人參空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與流動相標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值評價ME，當(dāng)ME在85%～115%時，則基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。當(dāng)ME小于85%或大于115%時，為基質(zhì)抑制或增強(qiáng)[18]。經(jīng)初步檢測，大部分植物生長調(diào)節(jié)劑存在基質(zhì)抑制，應(yīng)該對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正，故本試驗采用人參空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 檢出限和定量限、線性范圍

用人參空白基質(zhì)按1.2.4方法制備人參空白基質(zhì)提取液，稀釋混合對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液配制一系列濃度的基質(zhì)匹配對照品溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，植物生長調(diào)節(jié)劑定量離子對峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計算，得到相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比對應(yīng)的最小濃度作為檢出限，10倍信噪比對應(yīng)的最小濃度作為定量限。結(jié)果見表2。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection（LOD）and limits of quantification（LOQ）of plant growth regulators

續(xù)表2 植物生長調(diào)節(jié)劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Continue table 2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection（LOD）and limits of quantification（LOQ）of plant growth regulators

結(jié)果表明19種植物生長調(diào)節(jié)劑在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。由于試驗初步篩選過程中未發(fā)現(xiàn)氯化膽堿的人參空白藥材，故采用初始梯度溶劑進(jìn)行氯化膽堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，而實際測試過程中存在基質(zhì)效應(yīng)，因此氯化膽堿的方法學(xué)考察結(jié)果及定量范圍僅供參考。大部分化合物在0.025 μg/kg～5 μg/kg滿足其定量檢測要求。氯苯胺靈響應(yīng)較低，定量限為50 μg/kg。

2.2.2 精密度

選取濃度為50 ng/mL的流動相混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按質(zhì)譜、色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，連續(xù)測定6次，19種植物生長調(diào)節(jié)劑的RSD在1.09%～5.57%（n=6），結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.3 加樣回收

本試驗進(jìn)行了 25、50、100 μg/kg 3 個水平（n=5）的加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表3。

表3 19種植物生長調(diào)節(jié)劑的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Average recoveries and RSDs of 19 PGRs

所有化合物平均回收率均大于74%，RSD小于15%，滿足考察要求。

2.3 樣品測定

應(yīng)用本試驗的方法對12批樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖2。12批人參樣品共檢測出氯化膽堿、矮壯素、丁酰肼3種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留。其中氯化膽堿在12批藥材中均有檢出，殘留最多；其次為矮壯素，10批人參樣品顯陽性；8批藥材中檢測到丁酰肼殘留。

圖2 人參樣品中的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatograms of ginseng sample

2.4 膳食評估

人參為藥食同源植物，由于各國文化背景、飲食習(xí)慣等不同，關(guān)于人參的分類也有所差異。在我國GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中將人參歸為“藥用植物”，歐盟則將人參歸類在“茶、咖啡、草本浸劑、可可和角豆樹”，食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）、韓國和加拿大將人參分在“塊根和塊莖類蔬菜”里，而人參在日本則被作為“其他蔬菜”[19]。在中國，人參作為滋補(bǔ)圣品，是餐桌上的“常客”，因此本研究以果蔬類的植物生長調(diào)節(jié)劑攝入風(fēng)險評估作為人參的評價依托。評估結(jié)果如表4所示。

根據(jù)檢測結(jié)果可知，12批人參中矮壯素的HQ為1.20×10-4～1.50×10-3，氯化膽堿為 5.61×10-2～7.97×10-2，丁酰肼為1.88×10-6～1.33×10-5，遠(yuǎn)低于風(fēng)險值1。氯化膽堿與矮壯素同屬季銨類化合物，在結(jié)構(gòu)上非常相似，兩者之間僅相差一個氯離子，因此本文擬采用矮壯素的ADI值進(jìn)行評估。二者均能引起皮膚、眼睛等刺激不適，且在部分植物體內(nèi)矮壯素可轉(zhuǎn)化為氯化膽堿[20]，此處氯化膽堿的高檢出極有可能是過量矮壯素在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化而成，基于累積風(fēng)險考慮，本文進(jìn)一步采用HI法做了氯化膽堿、矮壯素初級的累積風(fēng)險評估。結(jié)果表明估值為0.056～0.081，小于風(fēng)險值1，未達(dá)到健康關(guān)注水平，因此人參膳食攝入風(fēng)險較低。反觀所檢出物質(zhì)的檢出率，氯化膽堿可達(dá)100%，矮壯素、丁酰肼分別為83.3%、66.7%。檢出的3種化合物均屬于植物生長延緩劑類，主要作用為抑制植物光呼吸，促進(jìn)根系膨大，提高塊根和塊莖產(chǎn)量，由此可推測植物生長延緩劑在人參種植過程中應(yīng)用十分廣泛。

我國《農(nóng)藥管理條例》將PGR作為農(nóng)藥而進(jìn)行統(tǒng)一管理。不同的是PGR不以殺傷有害生物為目的，所以其毒性不強(qiáng)，一般為低毒或微毒。但經(jīng)動物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，即使動物每天攝入的矮壯素低于人類每日允許攝入量，也會對其生殖能力產(chǎn)生不良的影響。丁酰肼在植物體內(nèi)較穩(wěn)定，可通過食物鏈傳輸，進(jìn)而影響人體健康。同時植物生長調(diào)節(jié)劑的濫用，尤其是難降解的化合物，在土壤中有富集作用，會繼續(xù)進(jìn)入到后茬作物中，對其生長發(fā)育產(chǎn)生影響。因此不合理使用，對作物本身及人體都是有害的，相關(guān)部門對此應(yīng)引起足夠的重視，及時制定相關(guān)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)及合理使用準(zhǔn)則。

3 結(jié)論

本文通QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定了人參中19種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量，方法學(xué)考察及實際樣品測定證明該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確度高、成本小等優(yōu)點(diǎn)，具有一定的推廣價值。文章進(jìn)一步對檢出的3種植物生長調(diào)節(jié)劑做了膳食攝入風(fēng)險評估。總體趨勢為延緩類的PGR檢出率高，但殘留量較低，未達(dá)到健康關(guān)注水平。在評估過程中本文選用的是人均人參消費(fèi)量，因個體差異，消費(fèi)量也有所不同，因此結(jié)果具有可參考性。在實際生活中，人們飲食多以復(fù)合結(jié)構(gòu)為主，因此僅探討一類樣品在一定程度上估值會偏低，后續(xù)探究應(yīng)注重檢測多品類作物（如谷類、蔬菜、水果、茶飲等）中植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留，對于有相同毒性機(jī)制的化合物進(jìn)行相應(yīng)的累積風(fēng)險評估，結(jié)果更能代表真實客觀情況。類似于人參這種藥食同源的植物，廣泛存在我們的餐飲及日常保健食品中，但植物生長調(diào)節(jié)劑的使用尚缺少足夠的科學(xué)研究和應(yīng)用指導(dǎo)，使用不規(guī)范導(dǎo)致的殘留問題可能較其他農(nóng)作物更為嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。本文是對植物生長調(diào)節(jié)劑多殘留檢測技術(shù)及膳食風(fēng)險的進(jìn)一步探索，為規(guī)范人參種植過程中植物生長調(diào)節(jié)劑使用行為提供了理論支持。