杜京京,楊松,朱倩,伍玉菡,郭家剛,江艦
(安徽省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,安徽 合肥 230001)
膳食纖維(dietary fiber,DF)主要是植物的細胞壁多糖,不能被人體消化道的內源酶消化[1]。膳食纖維通常分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber,IDF),主要包括纖維素、木質素和非淀粉多糖[2](如半纖維素、果膠和阿拉伯木聚糖低聚糖)。膳食纖維在人體小腸內不能被消化吸收,故其能夠以基本完整的形式進入結腸,從而增加糞便的黏度和體積[3]。飲食干預研究表明,補充膳食纖維可以有益地改變腸道的微生物群,保護腸道屏障功能,對維持機體正常生理功能具有重要作用[4-5]。
生姜(Zingiber officinale Roscoe)是姜科植物,在世界各地被用作香料[6]、調味品[7]和傳統(tǒng)草藥[8]。生姜中主要含有淀粉、脂肪、蛋白質、纖維素、維生素等多種成分[9]。生姜加工過程中剩余的姜渣中含大量的膳食纖維,但由于主要成分是不溶性膳食纖維,姜渣與蛋白、淀粉等結合程度較差,不利于作為食品原料進行加工,從而導致其利用率較低。通過利用酸堿化學法[10]、酶法[11]、生物發(fā)酵法[12]等方法對果蔬殘渣進行改性處理,可以有效提高果蔬殘渣中可溶性膳食纖維含量,增加了果蔬殘渣作為食品原料的可操作性[13]。微生物發(fā)酵法改性果蔬殘渣中膳食纖維是一種相對高效且低成本的手段[14]。因此,本文采用保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌復合菌種發(fā)酵改性姜渣膳食纖維,以提高姜渣中可溶性膳食纖維的含量,制備高品質的姜渣膳食纖維,提高姜渣的利用價值。
1.1.1 試驗材料與試劑
山東泥姜:市售;脫脂奶粉:雀巢(中國)有限公司;果葡糖漿:邢臺平安糖業(yè)有限公司;保加利亞乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌(商業(yè)凍干粉100億cfu/g,食品級):鄭州百益寶生物技術有限公司。
1.1.2 試驗設備
破壁機(L12-Y3):九陽股份有限公司;紗布:常州富羽萊貿易有限公司;智能恒溫培養(yǎng)箱(HW-80):遼寧賽亞斯科技有限公司;電熱恒溫干燥箱(DHG-9203A):甘易儀器設備(上海)有限公司;高壓滅菌鍋(BKQ-B50II):鑫貝西科學儀器(山東)有限公司;高速離心機(TGL-16):浙江納德科學儀器有限公司;X射線衍射(X’Pert MP):荷蘭Nalytical公司;掃描電鏡(SU8220):日本日立公司;固體核磁共振(Bruker AVANCE III 400 WB):瑞士布魯克公司。
取一定量的山東泥姜,切碎。稱取500 g姜碎和2 000 mL 蒸餾水,用破壁機攪碎(20 min),煮沸 5 h,用紗布(4層)過濾。過濾后得到的姜渣在60℃下干燥48 h。稱取干燥姜渣5.0 g和蒸餾水按照一定的料液比調配均勻,將脫脂奶粉1.0 g和果葡糖漿1.0 g加入到液料中,攪拌溶解,裝于發(fā)酵罐中,置于高壓滅菌鍋中,120℃滅菌20 min。冷卻后,接種2%保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌(1∶1,質量比),在一定條件下進行發(fā)酵,發(fā)酵結束后,加入樣本3倍體積的95%乙醇,靜置12 h,過濾并收集濾渣。將濾渣在60℃下干燥24 h,即得到改性后的姜渣。
根據(jù)GB 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》[15],以姜渣中可溶性膳食纖維(SDF)得率為考察指標,分別對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、料液比3個因素進行單因素試驗。初步確定復合菌種發(fā)酵姜渣的最佳工藝條件。
采用Design-Expert 12.0軟件中Box-Behnken試驗設計方案,根據(jù)前期試驗研究結果,選取發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵溫度(B)和料液比(C)3個條件進行響應面優(yōu)化,試驗安排見表1。
表1 響應面設計因素水平Table 1 The factors and levels of response surface for ginger dregs
1.5.1 姜渣持水力的測定
取發(fā)酵前后的姜渣各1.00 g分別置于100 mL燒杯中,分別加入50 mL蒸餾水,在室溫(27℃)下用磁力攪拌器攪拌30 min,4 000 r/min離心20 min,除去上層水分,稱取殘留物的質量(g),按照式(1)計算持水力,并比較兩者之間持水力的變化。
1.5.2 姜渣溶脹力測定
取發(fā)酵前后的姜渣各1.00 g,加入20 mL量筒中,搖動樣品,使其在量筒中平鋪均勻,記錄下此時干樣品的體積(mL),分別加入10 mL蒸餾水,均勻振蕩后,在室溫(25℃)下靜置24 h后,分別記錄此時樣品的體積(mL),比較兩者溶脹力的變化并按式(2)計算。
1.6.1 光學顯微鏡(optical microscope,OPM)觀察
取少量發(fā)酵前后的姜渣置于凹槽載玻片上,用乙醇∶甘油(2∶1,體積比)分散,蓋上蓋玻片,置于顯微鏡下觀察。
1.6.2 掃描電鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)觀察
取發(fā)酵前后的姜渣,用棉棒沾取少量,分別放于導電膠上,噴鍍,采用SEM觀察。
1.6.3 X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD)測定
XRD的主要掃描參數(shù)如下:Cu靶,測試電壓40kV,電流 40 mA;掃描速度 2°/min,掃描范圍 3°~40°。
1.6.413C固體核磁共振波譜(solid-state nuclear magnetic resonance spectrometer,CP MAS NMR)測試
13C CP MAS NMR測試的操作頻率為75.5 MHz。樣品放入4 mm的ZrO2回轉管中,轉速是5 kHz,補償時間20 ms,接觸時間1 ms,2個脈沖之間延遲3 ms。
試驗數(shù)據(jù)均平行測定3次,以平均值±標準差的方式表示最終的結果。數(shù)據(jù)采用origin 9.0統(tǒng)計軟件進行分析。響應面試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 12.0進行分析。
2.1.1 發(fā)酵溫度對姜渣中SDF得率的影響
準確稱取5.0 g未發(fā)酵的姜渣置于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中,在發(fā)酵液料中加入2%的發(fā)酵劑,然后分別在38、40、42、44、46 ℃的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng) 48 h,測定 SDF得率,結果如圖1所示。
圖1 發(fā)酵溫度對姜渣中SDF得率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of SDF in ginger dregs
由圖1可知,隨著發(fā)酵溫度的逐漸升高,SDF得率不斷增加,當發(fā)酵溫度為42℃時,姜渣中SDF得率達到最大。發(fā)酵溫度繼續(xù)增加,SDF得率顯著下降,這可能是因為過高的發(fā)酵溫度抑制了復合菌種的反應活性。因此,選擇42℃為最佳發(fā)酵溫度。
2.1.2 發(fā)酵時間對姜渣中SDF得率的影響
準確稱取5.0 g未發(fā)酵的姜渣置于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中,在發(fā)酵液料中加入2%的發(fā)酵劑,在42℃下分別培養(yǎng) 24、36、48、60、72、84 h,測定 SDF 得率,結果如圖2所示。
圖2 發(fā)酵時間對姜渣中SDF得率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of SDF in ginger dregs
由圖2可知,姜渣中SDF得率隨發(fā)酵時間的增加先增加后減少,在48 h達到最大值。處于較短的發(fā)酵時間時,菌種處于生長期,菌種的數(shù)量和活力均較低。隨著發(fā)酵時間的增加,菌種生長到達穩(wěn)定期,姜渣中SDF得率逐漸達到最大值。持續(xù)發(fā)酵后,菌種的活力下降,發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不斷增加,部分SDF被分解,造成得率下降。因此,選擇48h為最佳的發(fā)酵時間。
2.1.3 料液比對姜渣中SDF得率的影響
按照料液比 1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)將未發(fā)酵的姜渣與發(fā)酵液混合,分別在液料中加入2%的發(fā)酵劑,在42℃下培養(yǎng)48 h,測定SDF得率,結果如圖3所示。
圖3 料液比對姜渣中SDF得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of SDF in ginger dregs
由圖3可知,隨著溶劑添加量增加,菌種與姜渣的接觸更加充分,姜渣中SDF得率增加,在料液比為1∶15(g/mL)時達到最大值。但當溶劑添加量大于1∶10(g/mL)后,姜渣中SDF的含量變化趨勢平緩后下降,可能是由于隨著水體積的繼續(xù)增大,反應底物被稀釋。因此,選擇1∶10(g/mL)為最佳發(fā)酵液料比。
2.1.4 響應面結果與分析
根據(jù)單因素試驗結果,選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料液比3個因素的最優(yōu)試驗條件,采用Box-Benhnken試驗設計對姜渣發(fā)酵條件進行3因素3水平的響應面分析試驗,包括17個析因試驗和5個中心試驗。運用Design-Expert 12.0軟件中Box-Behnken程序對各個試驗點的響應值進行回歸分析,試驗結果見表2。利用ANOVA分析表2數(shù)據(jù),結果見表3。
表2 Box-Behnken試驗設計及相應結果Table 2 Box-Behnken design and the experimental results
表3 回歸方程中回歸系數(shù)的估計值及方差分析Table 3 Results of the Box-Behnken design regression analysis
該試驗回歸方程為:R1=9.412+0.05125A+0.03375B+0.032 5C-0.017 5AB+0.005AC+0.035BC-0.099 75A2-0.247 5B2-0.176 725C2。
該模型的復相關系數(shù)的平方R2=99.63%,說明回歸方程的擬合程度良好,失擬較小,可以用該方程進行模擬分析。失擬項的P=0.127 5,沒有顯著性影響,信噪比為15.838遠大于4,說明數(shù)據(jù)中沒有異常點,回歸方程擬合度和可信度較高,模型適當。
通過表3中P值可知:方程中A2、B2、C2對SDF得率的影響達到極顯著水平,BC、AB為影響顯著,表明試驗因子的二次項對響應值影響較大,這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著相對應。當姜渣SDF得率最大時,A=0.021;B=0.01;C=0.01;從而分析得到姜渣發(fā)酵的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度42.02℃,發(fā)酵時間48.01 h,料液比 1∶10.01(g/mL),得到姜渣 SDF 得率為9.416%。根據(jù)實際操作性,發(fā)酵工藝采用發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時間 48 h、料液比 1∶10(g/mL),實際測得SDF得率為9.42%,兩者相對誤差很小。因此,Box-Behnken試驗設計所得的最佳工藝參數(shù)準確可靠,具有實用價值。
各個因子交互作用的響應面的3D和等值線分析如圖4~圖6所示。
圖4 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對SDF得率響應面分析Fig.4 The analysis on response surface of fermentation time and fermentation temperature
圖5 發(fā)酵時間和料液比對SDF得率響應面分析Fig.5 The analysis on response surface of fermentation time and solid-liquid ratio
圖6 發(fā)酵溫度和料液比對SDF得率響應面分析Fig.6 The analysis on response surface of fermentation temperature and solid-liquid ratio
由圖4可知,圖形略呈橢圓形,說明發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的具有一定的交互作用。發(fā)酵溫度的軸向等高線變化比發(fā)酵時間軸向等高線的變化相對密集。因此,發(fā)酵溫度對響SDF得率的影響較發(fā)酵時間影響大。
由圖5可知,當發(fā)酵溫度位于中心水平時,圖形呈圓形,發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的交互作用不強。
由圖6可知,圖形呈現(xiàn)橢圓形,說明發(fā)酵時間和料液比的交互作用顯著。發(fā)酵溫度的軸向等高線的密集程度顯著高于料液比軸向等高線的變化。因此,發(fā)酵溫度對SDF得率的影響較料液比影響大。
2.2.1 發(fā)酵對姜渣持水力和溶脹力的影響
發(fā)酵對姜渣持水力和溶脹力的影響如表4所示。
表4 發(fā)酵對姜渣的膨脹力和持水力的影響Table 4 Effect of fermentation on swelling power and water holding capacity of ginger dregs
由表4可知,發(fā)酵后姜渣的膨脹力和持水力分別增加了35.96%和9.97%。姜渣中含有大量的膳食纖維素。這些膳食纖維素存在著無定形區(qū),當吸水后,無定區(qū)變大,膳食纖維表現(xiàn)出膨脹。膳食纖維的大分子中含有許多—OH,可以與H2O分子形成配位鍵,形成持水力。發(fā)酵后姜渣的膨脹力和持水力均提高,說明發(fā)酵促使姜渣中形成了更多聚合度低、具有無定型結構的可溶性膳食纖維,同時,姜渣膳食纖維的結構更加疏松,更多親水基團(如—OH)暴露出來。姜渣的持水力增加,加工性能提升,可用于食品工業(yè)中食品品質改性,如改善食品黏度與質構特性等。
2.2.2 發(fā)酵對姜渣結構的影響
在光學顯微鏡下觀察發(fā)酵對姜渣結構的影響,結果如圖7所示。
圖7 姜渣發(fā)酵前和發(fā)酵后的顯微鏡圖片(20×20倍)Fig.7 The microscope images of ginger dregs before fermentation and after fermentation
從圖7可以看出,發(fā)酵前姜渣中的纖維素等交錯重疊,呈現(xiàn)面積較大的團聚物。發(fā)酵后,團聚物體積減小,纖維結構的交錯減少,碎片結構增加。發(fā)酵促使姜渣的團聚減小、比表面積增大,增加了纖維中的親水基團暴露率,提高姜渣的持水力和膨脹力。
2.2.3 發(fā)酵對姜渣微觀結構的影響
在掃描電鏡下觀察發(fā)酵對姜渣微觀結構的影響,結果如圖8所示。
圖8 姜渣發(fā)酵前后的SEM圖片F(xiàn)ig.8 SEM images of ginger dregs before and after fermentation
圖8A1~A2顯示了未發(fā)酵的姜渣有完整清晰的纖維結構,纖維聚集在一起,形成網(wǎng)絡空腔結構,團聚的顆粒表面也具有大量褶皺。圖8B1~B2顯示,發(fā)酵在一定程度上分解了姜渣纖維的微結構、切斷其大分子結構,形成了分子量較小、鏈長較短的結構。圖8B2顯示發(fā)酵后姜渣中的物質干燥后粘結成片層狀,說明水溶性物質增多,樣品干燥后更易粘結。
2.2.4 發(fā)酵對姜渣晶體結構的影響
在XRD下觀察發(fā)酵對姜渣晶體結構的影響,結果如圖9所示。
圖9 姜渣發(fā)酵前后的XRD圖片F(xiàn)ig.9 XRD pictures of ginger dregs before and after fermentation
圖9顯示,姜渣發(fā)酵后,14°和16°左右的峰消失,說明姜渣中體積較大的晶體結構減少。20°和22°的峰的分辨率下降,說明發(fā)酵后姜渣中無定型物質(如SDF等)增加。
2.2.5 發(fā)酵對姜渣13C CP MAS NMR圖譜的影響
在13C CP MAS NMR下觀察發(fā)酵對姜渣晶體結構的影響,結果如圖10所示。
圖10 姜渣發(fā)酵前后的13C CP MAS NMR圖片F(xiàn)ig.10 13C CP MAS NMR images of ginger dregs before and after fermentation
由圖10可知,發(fā)酵前姜渣的結構中C1的信號峰位于 92×10-6~108×10-6;C2、C3 和 C5 的信號峰出現(xiàn)在65×10-6~75×10-6之間;C4 和 C6 的信號峰則分別位于75×10-6~85×10-6和 55×10-6~62×10-6處。發(fā)酵對姜渣的核磁共振圖譜的分辨率的差異主要在C1位置。姜渣經(jīng)過發(fā)酵處理后,C1位置出現(xiàn)了兩個顯著的峰形,說明發(fā)酵后纖維的聚集程度降低,結構更加松散,原本重疊的信號峰被區(qū)分出來。
采用接種2%復合菌種,發(fā)酵制備姜渣SDF的最佳工藝參數(shù)如下:發(fā)酵溫度42℃、發(fā)酵時間48 h、料液比1∶10(g/mL),該條件下發(fā)酵姜渣中SDF的得率為9.42%。發(fā)酵后的姜渣的SDF含量顯著提升,膨脹力和持水力增加。通過顯微觀察和結構測定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后姜渣的表面結構改變,無定型物質增多,膳食纖維結構更加規(guī)整。乳酸菌復合發(fā)酵法可以提高姜渣中SDF的含量,但是對于發(fā)酵后姜渣膳食纖維的物質組成及結構變化有待進一步研究。