徐亞男， 劉懿萱， 廉美蘭， 金美玉， 樸炫春

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種十分常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，廣泛存在于自然界中，傳播途徑較多，常在食品加工或醫(yī)療過(guò)程中被檢測(cè)到，危害性較強(qiáng)[1]。金黃色葡萄球菌感染后極易引發(fā)皮膚傷口感染及膿腫，如肺炎，腦膜炎，心內(nèi)膜炎，敗血癥[2]，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。因此，為了減少由細(xì)菌感染引起的死亡，人們發(fā)現(xiàn)并開(kāi)始使用抗生素，但隨著細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生令抗生素作用漸漸降低。而利用植物做成的天然制劑毒副作用小，有效成分多，可以代替抗生素的使用。許多研究表明，天然植物制劑可以通過(guò)改變菌細(xì)胞的通透性，使膜內(nèi)物質(zhì)溢出，核酸泄露，細(xì)菌繁殖受到抑制，無(wú)法完成正常代謝，具有很好的抑菌作用。如：秦皮素可明顯抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[3]；蒲公英植酸對(duì)沙門(mén)氏菌具有較強(qiáng)的抑制作用，通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性，干擾蛋白質(zhì)代謝進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[4]；芳樟醇可以影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞膜通透性增大，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)丟失，ATP含量下降，細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)是藤黃科金絲桃屬的多年生草本植物，被稱(chēng)為“植物藥之星”[6]，主要產(chǎn)于新疆、山東等地區(qū)，國(guó)外南歐、非洲也有所分布，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，具有極高的藥用價(jià)值[7-12]，含有金絲桃素、金絲桃苷等。研究表明，貫葉連翹粗提物對(duì)許多細(xì)菌都有抑制作用，如蠟樣芽孢桿菌[13]、黃色短桿菌[14]、枯草桿菌[15]、金黃色葡萄球菌[16]等。然而，具體抑菌機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，該試驗(yàn)研究了貫葉連翹不定根粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制機(jī)制，旨在為貫葉連翹不定根作為天然植物制劑應(yīng)用于相關(guān)抑菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)使用于曉坤[17]方法獲得貫葉連翹不定根。將貫葉連翹不定根切成1 cm大小，接種于含有4 L培養(yǎng)基的氣升式球形反應(yīng)器中，培養(yǎng)基配方為MS+ IBA 1.25 mg/L+蔗糖40 g/L，pH值5.8 ，通氣量為0.1 vvm，培養(yǎng)30 d后，獲得材料，材料流水沖洗1 min并于烘干箱中烘干，即得貫葉連翹不定根干品，用于下述試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種的培養(yǎng)

金黃色葡萄球菌購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。用接種環(huán)挑取菌種，培養(yǎng)于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(3 g/L牛肉膏+10 g/L蛋白胨+5 g/L氯化鈉+15～20 g瓊脂、pH值7.0～7.2)，37 ℃菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用平板劃線法培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，稀釋至菌液濃度107～108CFU/mL，用于下述試驗(yàn)。

1.2.2 粗提物的制備

稱(chēng)取不定根干品2 g，利用閃式提取儀(JHBE-50T，上海釩幟精密設(shè)備有限公司)在提取時(shí)間65.44 s，甲醇濃度77.46%，料液比52.13 mL/g條件下進(jìn)行提取，經(jīng)減壓濃縮后烘干至恒重，即得粗提物(HE)，提取率為30%。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定

利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑法[18](TTC)測(cè)定HE的最低抑菌濃度(MIC)。96孔板中每孔加入100 μL上述菌液和不同濃度的HE(64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg/mL)后，以菌培養(yǎng)液作為對(duì)照，重復(fù)處理3次。在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，加入20 μL 0.2% TTC(北京索萊寶科技有限公司)溶液，再置于37 ℃下避光培養(yǎng)4 h，觀察各處理組反應(yīng)液的顏色，確定MIC。

1.2.4堿性磷酸酶(AKP)酶活性測(cè)定

菌液中AKP酶的活性用AKP酶試劑盒(南京建成科技有限公司)測(cè)定。150 mL錐形瓶中加入2 mL菌液和100 mL菌培養(yǎng)液，加入2 mg/mL(MIC)HE(5 mL)，對(duì)照加入菌培養(yǎng)液，于37 ℃下溫育(130 r/min)4 h后，在5 000 r/min下離心8 min，取上清液作為待測(cè)樣品。按照AKP酶試劑盒的說(shuō)明書(shū)，空白組加入25 μL雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)品組加入25 μL酚標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg/mL)，樣品組加入25 μL待測(cè)樣品，最后分別加入1.5 mL顯色劑、50 μL緩沖液和50 μL基質(zhì)液。在分光光度計(jì)520 nm下測(cè)吸光度，計(jì)算AKP酶活性。

1.2.5 電導(dǎo)率(EC)測(cè)定

參照Yuan等[19]的方法測(cè)定菌液的電導(dǎo)率。在15 mL離心管中加入5 mL菌液，離心去上清，用PBS(10 mM，pH值7.4)洗滌3次后，加入5 mLPBS和HE后搖勻混合，使HE終濃度達(dá)到MIC(對(duì)照組加入等體積的菌培養(yǎng)液)?；旌衔镉?30 r/min下溫育(37 ℃)，用電導(dǎo)率儀(DDSJ-308A，雷磁)測(cè)定不同時(shí)間的EC值。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定胞外蛋白質(zhì)濃度。將菌液離心去上清，菌細(xì)胞用PBS(10 mM，pH值7.4)洗滌3次，依次加入1 mL PBS、100 mL菌培養(yǎng)液和HE，使HE終濃度達(dá)到MIC(對(duì)照組加入等體積的菌培養(yǎng)液)?；旌弦弘x心4 min，取上清為待測(cè)樣品。空白組加入25 μL雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)品組加入25 μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，樣品組加入25 μL待測(cè)樣品，最后加入1.5 mL顯色劑。充分反應(yīng)10 min后利用分光光度計(jì)于595 nm下測(cè)量吸光值。

1.2.7 核酸泄露測(cè)定

將菌液離心去上清，用PBS(10 mM，pH值7.4)洗滌3次后，加入1 mL PBS和100 mL菌培養(yǎng)液，加入HE，使HE終濃度達(dá)到MIC(對(duì)照組加入等體積的菌培養(yǎng)液)，離心4 min后，去上清，利用分光光度計(jì)在260 nm下測(cè)量吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., SanDiego, CA)進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，顯著性為P<0.05，所有試驗(yàn)均采用3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HE的抑菌活性

TTC作為一種氧化還原指示劑，可將活細(xì)胞被染成不同程度的紅色。從圖1可以看出，當(dāng)HE濃度在2 mg/mL時(shí)，沒(méi)有產(chǎn)生明顯紅色沉淀，2 mg/mL之前的樣品均呈現(xiàn)出不同程度的紅色，表明在HE濃度在2 mg/mL時(shí)，可以有效的抑制金黃色葡萄球菌的增殖，即HE的MIC為2 mg/mL。

加入HE后，細(xì)菌生長(zhǎng)明顯減緩，處理1.5 h時(shí)，對(duì)照組與HE處理組細(xì)菌生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯不同，對(duì)照組細(xì)菌在2～3 h達(dá)到快速繁殖期，而HE處理組生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明HE能夠有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)(圖2)。

2.2 HE對(duì)AKP酶活性的影響

AKP酶僅存在于細(xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間，參與細(xì)胞膜上的能量代謝，而在細(xì)胞壁完整的狀態(tài)下，在胞外無(wú)法檢測(cè)到AKP酶，只有細(xì)胞壁損傷時(shí)才能泄漏到菌液中。從圖3中可以看出，處理前在菌液中只能檢測(cè)到微量的AKP酶活性，而處理4 h后，胞外AKP酶活性有極顯著升高，說(shuō)明HE對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁有較好的破壞效果。

2.3 HE對(duì)電解質(zhì)泄露的影響

從圖4可以看出，加入HE后，電導(dǎo)率逐漸上升，在2 h后達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。這表明在加入HE后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，會(huì)造成胞內(nèi)K+、Ca2+、Na+等小分子物質(zhì)的泄露滲出，導(dǎo)致電導(dǎo)率升高。

2.4 HE對(duì)蛋白質(zhì)泄露的影響

蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，作為細(xì)胞中的重要組成部分，許多代謝活動(dòng)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。由圖5可知，加入HE后，處理組與對(duì)照組相比，蛋白質(zhì)濃度上升，可能是HE的加入，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，從而向外滲透蛋白質(zhì)。

2.5 HE對(duì)核酸泄露的影響

核酸是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)，其吸光峰值一般在260 nm左右，故以O(shè)D260測(cè)定值代表核酸的含量。在加入HE處理4 h后，菌液中核酸含量明顯上升，遺傳物質(zhì)泄露，細(xì)菌無(wú)法正常繁殖，從而有效抑制其正常生長(zhǎng)(圖6)。

3 討論與結(jié)論

細(xì)菌作為所有生物數(shù)量最多的一類(lèi)，廣泛存在于大自然中的各個(gè)角落，或與其它生物共生。金黃色葡萄球菌作為世界10大致死菌之一，通過(guò)食物、空氣、皮膚接觸皆可傳播，無(wú)時(shí)不刻不在危害人類(lèi)的健康。1928年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明首先發(fā)現(xiàn)了世界上第1種抗生素-青霉素，抗生素的出現(xiàn)極大減少由細(xì)菌感染造成的死亡[19]。隨著抗生素廣泛應(yīng)用于臨床，金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并且呈現(xiàn)多重耐藥性。在我國(guó)，每年有8萬(wàn)人因?yàn)E用抗菌藥物死亡，全國(guó)醫(yī)院抗菌藥物年使用率高達(dá)74%[20]。尋找替代抗生素的藥物成為急不可待的問(wèn)題。通常，藥用植物的天然產(chǎn)物是用于藥用制劑重要來(lái)源。

現(xiàn)如今，許多植物都已被證實(shí)具有抑制金黃色葡萄球菌的作用。通常植物抑菌機(jī)制主要有3種：1) 破壞細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜;2) 影響細(xì)菌呼吸;3) 影響細(xì)菌的遺傳物質(zhì)，抑制蛋白質(zhì)合成，從而起到抑菌的效果[21]。如夾江石斛水提物通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性從而起到抑制金黃色葡萄球菌的作用[22]；蔣斌等[23]人證實(shí)連翹能抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，作用機(jī)制可能與細(xì)胞膜通透性有關(guān)；蔣利榮等[24]人研究羊踟躕其粗提物可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜甚至細(xì)胞完整性，使得細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)電離子及核酸物質(zhì)外流，從而造成金黃色葡萄球菌的死亡。在該研究中，貫葉連翹不定根粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌MIC是2 mg/mL，加入粗提物后，細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，AKP酶活性增強(qiáng)，同時(shí)菌液電導(dǎo)率上升，胞外蛋白質(zhì)含量增多，核酸泄露增多，說(shuō)明粗提物可使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，膜內(nèi)物質(zhì)滲出，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。因此，為貫葉連翹不定根粗提物作為天然植物制劑代替抗生素的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。