秦 露， 韓 蕊， 張 先, 李范洙

(延邊大學 農(nóng)學院，延吉 吉林 133002)

寒蔥(AlliumvictorialisL.)是百合科、蔥屬的多年生草本植物，學名為茖蔥，別名山蔥、鹿耳蔥等。寒蔥主要分布于北半球溫帶，在半蔭環(huán)境下生長良好，耐寒且遇寒生長更旺盛，味辛辣如蔥而得名“寒蔥”，有止血、散淤、化痰、止痛的功效。寒蔥含有蔥香，具有味美、腌制后爽口甘甜的特點，享有“菜中靈芝”的美譽。寒蔥營養(yǎng)豐富、風味獨特，是一種具有重要生物學功能和營養(yǎng)價值的綠色植物。寒蔥中富含維生素 C、氨基酸及有利于人體健康的活性成分，如多酚、黃酮[1]等。

目前國內(nèi)的寒蔥研究大多與其栽培種植[2-5]及成分生物活性[6-9]相關(guān)，鮮見關(guān)于寒蔥蛋白提取及營養(yǎng)評價方面的研究。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，寒蔥與其他植物相比蛋白質(zhì)含量較高。有研究表明，長期攝入動物蛋白可能會增加患肥胖癥及糖尿病的風險[10]，而植物蛋白與動物蛋白相比，不含膽固醇，更加健康，并能減輕人體腎臟負擔[11]；且植物蛋白資源可循環(huán)再生，對環(huán)境友好[12]，可將其替代或部分替代動物蛋白，滿足人體對蛋白質(zhì)的攝入要求[13]。

該試驗通過響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶復合堿提酸沉法提取寒蔥蛋白的工藝條件，并對所得寒蔥蛋白進行營養(yǎng)價值評價，為植物蛋白資源的開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2020年夏季采摘新鮮吉林省延邊地區(qū)的野生寒蔥置于55 ℃鼓風干燥箱中烘干，然后用高速多功能粉碎機粉碎后過100目篩，得到寒蔥干燥粉，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

牛血清蛋白標準品，購于上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸鈉，分析純，購于河南萬邦實業(yè)有限公司；其余常規(guī)試劑均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7504可見紫外分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)；QFST-250SQ索氏提取器(浙江托普儀器有限公司)；Scientz-10N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TDZ5-WS離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；L-8900氨基酸自動分析儀(島津國際貿(mào)易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 寒蔥蛋白提取工藝

寒蔥蛋白的提取參照丘苑新等[14]的方法，取3 g寒蔥粉，加入2%的纖維素酶，浸泡于一定比例的水中，并按照單因素相應(yīng)的試驗條件進行試驗，將其水解完畢后于80 ℃水浴鈍化酶活性，冷卻至常溫后用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至10，在50 ℃條件下水浴2.5 h，冷卻至常溫后在4 000 r/min離心15 min取上清液，進行沉淀復提，合并上述2次上清液，取1 mL用于之后的蛋白質(zhì)含量測定。用0.1 mol/L HCl將上清液pH值調(diào)節(jié)至等電點3.5，靜置1 h后在4 000 r/min離心15 min取沉淀，使用真空冷凍干燥機干燥48 h即可得到寒蔥蛋白粉。

1) 單因素試驗

①酶解溫度對寒蔥蛋白提取率的影響

在酶解時間2 h，料液比1∶50 (g∶mL)條件下，選擇酶解溫度30、40、45、50、55和60 ℃分別酶解，重復3次，根據(jù)最終蛋白質(zhì)的提取率確定最優(yōu)酶解溫度。

②酶解時間對寒蔥蛋白提取率的影響

在酶解溫度45 ℃、料液比1∶50 (g∶mL)條件下，分別酶解1、1.5、2、2.5、3和3.5 h，重復3次，根據(jù)最終蛋白質(zhì)的提取率確定最優(yōu)酶解時間。

③料液比對寒蔥蛋白提取率的影響

在酶解溫度45 ℃、酶解時間2 h條件下，分別采用料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70 (g∶mL)進行試驗，重復3次，根據(jù)最終蛋白質(zhì)的提取率確定最優(yōu)料液比。

2) 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用Design-Expert8.0.6進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，以酶解溫度(A)、酶解時間(B)、料液比(C)這3個因素為自變量[15]，以試驗中寒蔥蛋白提取率的大小為響應(yīng)面的響應(yīng)值進行工藝條件優(yōu)化，相關(guān)試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

1) 牛血清蛋白標準曲線繪制

取考馬斯亮藍G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85%H3PO4,用蒸餾水稀釋至1 000 mL后，用濾紙于循環(huán)水真空泵中抽濾，制得考馬斯亮藍溶液[16]。

配制0.02、0.04、0.06、0.08、1.0 mg/mL牛血清蛋白質(zhì)溶液。分別吸取1 mL不同濃度的蛋白質(zhì)溶液于10 mL試管中，再向試管中加入5 mL考馬斯亮藍溶液，震蕩混勻，靜置2 min。在波長為595 nm處用分光光度計測定不同濃度的牛血清蛋白質(zhì)吸光度值，以蛋白質(zhì)標準溶液濃度為橫坐標，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標繪制牛血清蛋白質(zhì)標準曲線，最終得到回歸方程

y=0.507 5x+0.034 9，R2=0.993 7。

2) 蛋白質(zhì)含量測定方法及提取率計算

吸取1 mL蛋白質(zhì)提取液置于10 mL試管中，再加入5 mL考馬斯亮藍溶液，震蕩混勻，靜置2 min，于波長595 nm處測定寒蔥蛋白提取液的吸光度值，再根據(jù)蛋白標準曲線計算提取液中蛋白質(zhì)含量[17]。根據(jù)凱氏定氮法測定寒蔥中蛋白質(zhì)的總含量。寒蔥蛋白提取率[18]計算公式為：

寒蔥蛋白提取率/%=提取液中蛋白質(zhì)含量/寒蔥粉末中蛋白質(zhì)含量×100

(1)

1.3.3 氨基酸含量測定

根據(jù)GB/T5009.124-2016規(guī)定的試驗方法對寒蔥蛋白進行氨基酸組分分析。

在水解管中準確稱量0.2 g樣品，加入10 mL 6 mol/L HCl溶劑，在減壓的條件下將水解管密封后放入烘干箱，在110 ℃水解24 h，冷卻后過濾水解液，再旋蒸去除鹽酸，將所得試樣用0.02 mol/L HCl 溶劑定容至50 mL。該試樣使用時稀釋10倍，取少量稀釋后的水解液，再將其過0.02 μm的濾膜過濾，裝入進樣瓶中放入氨基酸自動分析儀中進行檢測。[19-20]

1.3.4 氨基酸營養(yǎng)價值評價方法

根據(jù)FAO/WHO共同修訂的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸模式譜，分析寒蔥氨基酸營養(yǎng)價值，具體指標包括：必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分數(shù)、氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)、氨基酸比值系數(shù)(RCAA)、氨基酸比值系數(shù)分(SRCAA)、必需氨基酸指數(shù)(EAAI)、生物價(BV)、營養(yǎng)指數(shù)(NI)[21-23]，各項指標計算公式如(2)～(8)。由于半胱氨酸與酪氨酸分別由甲硫氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)變而成，因此將苯丙氨酸和酪氨酸、甲硫氨酸與半胱氨酸分別合并計算[24]。

氨基酸評分(AAS)=(Ax/Fx)×100；

(2)

化學評分(CS)=(Ax/Ae)/(Ex/Ee)×100；

(3)

氨基酸比值系數(shù)(RCAA)=氨基酸比值/氨基酸比值的均值；

(4)

氨基酸比值系數(shù)分(SRCAA)=100-CV×100；

(5)

(6)

生物價(BV)=(1.09×EAAI-11.7)×100;

(7)

營養(yǎng)指數(shù)(NI)=EAAI×(Pp/100);

(8)

式中,Ax為待測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸含量(mg/g)；Fx為FAO/WHO評分標準模式中相應(yīng)的必需氨基酸含量(mg/g)；Ae待測蛋白質(zhì)中必需氨基酸總含量(mg/g)；Ex為標準雞蛋模式中相應(yīng)必需氨基酸含量(mg/g)；Ee為標準雞蛋模式中必需氨基酸總含量(mg/g)；氨基酸比值為某一必需氨基酸含量與FAO/WHO模式中相應(yīng)必需氨基酸含量的比值；CV為RCAA的變異系數(shù)，CV=標準差/均數(shù)；n為比較的必需氨基酸個數(shù)；Pp為待測蛋白質(zhì)的百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各項數(shù)據(jù)均重復試驗3次，并使用Excel 2010進行處理；對所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面設(shè)計；響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果較為顯著，模擬效果良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對寒蔥蛋白提取率的影響

隨著酶解溫度的逐漸升高，蛋白質(zhì)提取率先上升后下降(圖1)。當酶解溫度處于30～50 ℃時，寒蔥蛋白的提取率隨酶解溫度的升高而顯著上升，可能是由于纖維素酶在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，酶活性越強，寒蔥細胞壁上的纖維素更容易分解，使細胞中蛋白質(zhì)溶出，且溫度的提高會使分子擴散速率加快，由此增加蛋白質(zhì)溶出含量。當溫度為50 ℃時，寒蔥蛋白提取率達到峰值53.68%；而隨著酶解溫度的持續(xù)升高，寒蔥蛋白提取率下降顯著，可能是當溫度超過一定限度時，纖維素酶活性受到抑制甚至失活，或是溫度過高寒蔥蛋白變性導致其溶解性下降，從而蛋白質(zhì)提取率降低。所以，選擇酶解溫度42.5～52.5 ℃進行后續(xù)試驗。

2.1.2 酶解時間對寒蔥蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著酶解時間的逐漸增加，寒蔥蛋白的提取率先上升后趨于平緩。當酶解時間為1～2.5 h時，寒蔥蛋白提取率隨時間的增加而顯著上升，可能是因為在該酶解溫度和料液比時，提取時間越長，越有利于寒蔥蛋白的溶解。而隨著酶解時間繼續(xù)增加，寒蔥蛋白提取率基本保持不變，說明此時寒蔥蛋白溶解已達最大值，所以蛋白質(zhì)提取率變化較小；過長的酶解時間會使試驗耗時加長。因此，選擇酶解時間2～3 h進行后續(xù)試驗。

2.1.3 料液比對寒蔥蛋白提取率的影響

隨著料液比的升高，寒蔥蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢(圖3)。當溶液料液比為1∶30～1∶40時，寒蔥蛋白提取率隨料液比升高而顯著上升，可能是因為當料液比較低時，原料濃度較高，不利于寒蔥蛋白從中析出，所以在這個范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，寒蔥蛋白提取率提高。但隨著料液比持續(xù)增加時，蛋白質(zhì)提取率又急劇下降，可能是在料液比較高時，析出的蛋白質(zhì)成分隨雜質(zhì)一起離心析出，導致提取率下降。因此,選取料液比1∶30～1∶50進行后續(xù)試驗。

2.2 寒蔥蛋白提取工藝優(yōu)化

利用Box-Behnken[25]共設(shè)計出17組試驗，相應(yīng)的響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

液壓系統(tǒng)由電機—齒輪泵總成、手動應(yīng)急泵總成、高壓蓄能器總成、閥組總成、管路總成等組成。采用雙液壓源雙回路加蓄能器結(jié)構(gòu)，一套電機—泵總成工作，另一套備用，兩套同時出現(xiàn)問題時，可使用手動應(yīng)急泵應(yīng)急處理，具有多重保護功能，提高了可靠性和安全性。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6對響應(yīng)面模型結(jié)果進行擬合分析，以酶解溫度、酶解時間、料液比3個因素為自變量，以寒蔥蛋白提取率為響應(yīng)面響應(yīng)值的二元回歸方程為：Y=44.93-3.11A+2.70B+0.93C-2.64AB-0.55AC-0.69BC-2.82A2-2.45B2-0.70C2。

由表3可知，模型中1次項酶解溫度(A)、酶解時間(B)對寒蔥蛋白提取率影響極顯著，料液比(C)對寒蔥蛋白提取率影響不顯著；模型中AB對寒蔥蛋白提取率影響極顯著，AC、BC對寒蔥蛋白提取率影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析

此外，模型中F值為16.32，P<0.01，說明響應(yīng)面模型差異極顯著；失擬項P=0.112 6，遠大于0.05，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，說明試驗方法與設(shè)計合理可靠，且其他未知因素對試驗影響較小；其中模型決定系數(shù)R2=0.954 5，矯正系數(shù)R2=0.896 0，說明模擬預測值與真實試驗值在試驗范圍內(nèi)模擬度良好，所以，回歸方程可以用來分析與預測寒蔥蛋白提取的工藝結(jié)果。根據(jù)F值大小可知，影響寒蔥蛋白提取率因素的主次順序為：酶解溫度、酶解時間、料液比。

2.2.2 響應(yīng)面各因素相互作用分析

響應(yīng)面曲面的凹凸程度反映了各因素對寒蔥蛋白提取率影響的大小，響應(yīng)面曲率越大，說明響應(yīng)值對于因素大小的變化十分敏感；響應(yīng)面曲率較小時，說明響應(yīng)值對于因素大小的變化不敏感。圖4a為酶解溫度與酶解時間的交互作用結(jié)果，可見，寒蔥蛋白提取率隨溫度變化顯著，說明適宜的溫度對促進蛋白質(zhì)提取得率提高有著很關(guān)鍵的作用，在實際應(yīng)用中發(fā)揮較為積極的促進作用。而提取時間對提取率的影響也較為顯著，說明合適的提取時長也是影響提取率的有效手段之一。

圖4b為酶解溫度與料液比的交互作用結(jié)果，可見料液比在寒蔥蛋白提取過程中影響作用不顯著，說明提取時加入的水量在試驗中作用不大。

2.2.3 最佳工藝驗證試驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化回歸模型進行的工藝參數(shù)，確定提取寒蔥蛋白的最適工藝條件為酶解溫度42.5 ℃，酶解時間3 h，料液比1∶45.6，預測蛋白質(zhì)提取率為48.32%。為證明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計的合理性與可靠性，以上述條件進行3次驗證試驗，得到的蛋白質(zhì)提取率為48.23%，這與模型預測值的相對偏差為1.0%，說明該提取條件參數(shù)可靠，具有較好的可行性。

2.3 蛋白質(zhì)營養(yǎng)評價

將最佳工藝提取的蛋白質(zhì)進行氨基酸組分分析并進行營養(yǎng)評價。由表4可知，寒蔥蛋白共測得16種氨基酸，包括蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等7種人體必需氨基酸。寒蔥蛋白必需氨基酸總量為19.17 mg/g，非必須氨基酸31.47 mg/g，氨基酸總量達50.44 mg/g，必需氨基酸與總氨基酸(EAA/TAA)的比值為0.38，必需氨基酸與非必需氨基酸(EAA/NEAA)的比值為0.62。由此可以看出，寒蔥蛋白十分接近FAO/WHO提出的理想蛋白模式(EAA/TAA≈0.40，EAA/NEAA=0.60)的要求，因此，可確定寒蔥蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白。

表4 寒蔥蛋白中氨基酸種類及含量

由表5可知，寒蔥蛋白中含量最高的必需氨基酸為甲硫氨酸，占氨基酸總量的14.27%，高于FAO/WHO模式的10.00%，也高于全雞蛋模式的11.07%。甲硫氨酸在人體的生長發(fā)育過程中有著十分重要的作用，根據(jù)蛋白質(zhì)互補理論，可將寒蔥蛋白作為食品強化劑，與其他蛋白互補，提高各種食品的營養(yǎng)價值[26-27]，例如，補充大豆等谷物中含量不足的甲硫氨酸。因測得亮氨酸與賴氨酸氨基酸比值系數(shù)(RCAA)遠小于1，可知這2種氨基酸是寒蔥蛋白的限制氨基酸；且亮氨酸為寒蔥蛋白的第1限制氨基酸，所以將其評分分別作為寒蔥蛋白的化學評分和氨基酸評分[28]，得到寒蔥蛋白化學評分為4.78，氨基酸評分為2.57。

由表6對比可知，寒蔥蛋白營養(yǎng)價值評價指標較羊肚菌[29]稍高，而羊肚菌是眾所周知的營養(yǎng)豐富的食用菌之一，這是寒蔥蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白的又一證據(jù)。而寒蔥蛋白相較于黃豆[30]的各項營養(yǎng)指標較低，由測得數(shù)據(jù)及計算得知，是寒蔥蛋白中限制氨基酸亮氨酸含量過低，影響了寒蔥蛋白的必需氨基酸指數(shù)EAAI，進而使其余指標值偏低，且亮氨酸含量過低對其中的變異系數(shù)影響較大，導致其數(shù)值偏低。但其余相關(guān)指標符合FAO/WHO制定的氨基酸模式，所以寒蔥蛋白為優(yōu)質(zhì)植物蛋白的結(jié)論仍然正確。

表6 寒蔥蛋白營養(yǎng)價值評價

3 結(jié)論

該試驗通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗對寒蔥蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，其最佳工藝參數(shù)組合為酶解溫度42.5 ℃，酶解時間3 h，料液比1∶45.6，在此條件下進行3次驗證試驗，最后得到寒蔥蛋白提取率為48.23%，與預測值48.32%接近，說明該模型對試驗擬合程度較高，工藝合理可靠。將得到的寒蔥蛋白進行氨基酸組分分析并進行營養(yǎng)價值評價，可知寒蔥蛋白含人體所需的7種必需氨基酸，其中含量最高的必需氨基酸為甲硫氨酸，占氨基酸總量的14.27%，高于FAO/WHO模式的10%，也高于全雞蛋模式的11.07%。且必需氨基酸與非必須氨基酸的比值為0.62，必需氨基酸與氨基酸總量比值為0.38，由此可知，寒蔥蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。