劉懿萱， 徐亞男， 孫浩丁， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

貫葉連翹(Hypericumperforatum)，又名小汗淋草、過(guò)路黃，西方稱為圣約翰草，是藤黃科金絲桃屬的一種多年生草本植物，多產(chǎn)于我國(guó)新疆、山東、江蘇、江西等地，成熟全草可用藥，且具有悠長(zhǎng)的藥用歷史[1-3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，貫葉連翹具有很多藥理作用，如抗腫瘤、抗病毒、防衰老、抗抑郁、護(hù)肝等作用，已成為全球研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)藥材之一[4-7]。因貫葉連翹的廣泛應(yīng)用前景，近些年它的需求量急劇增加，導(dǎo)致其野生資源破壞，栽培產(chǎn)量和質(zhì)量滿足不了市場(chǎng)需求。因此，國(guó)內(nèi)外的研究學(xué)者不斷地尋找保護(hù)開(kāi)發(fā)資源的方法，其中,利用植物組織培養(yǎng)方法短期內(nèi)大量生產(chǎn)植物材料是緩解貫葉連翹資源問(wèn)題的有效途徑。研究表明，植物不定根培養(yǎng)與植物細(xì)胞或其它器官培養(yǎng)相比優(yōu)勢(shì)明顯[8-9]，且擁有原始植物根本身所具有的強(qiáng)大生物合成能力，同時(shí)可以表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的代謝活力[10]。

現(xiàn)代科學(xué)研究指出，過(guò)量自由基的產(chǎn)生往往與許多的慢性病和衰老緊密相關(guān)[11]?？寡趸梢杂行p輕其所帶來(lái)的危害程度，所以抗氧化相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)已成為醫(yī)療行業(yè)和化妝品企業(yè)主要研發(fā)方向之一[12]。天然植物抗氧化劑具有良好的抗氧化效果，且具有毒副作用小，安全性高，活性成分含量高等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。目前，已發(fā)現(xiàn)，植物器官培養(yǎng)物同樣具有很好的抗氧化活性。如，李慧娟等[15]發(fā)現(xiàn)，刺參不定根有明顯高于栽培植株的DPPH自由基清除能力；呂世鑫等[16]發(fā)現(xiàn)，西洋參不定根提取物具有強(qiáng)大的抗氧化活性。另外，研究發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取不定根提取物的抗氧化活性有很大差異，如高原等[17]發(fā)現(xiàn)，軟棗獼猴桃不定根乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇和水提取物中，乙酸乙酯提取物有最好的抗氧化效果；張聲源等[18]發(fā)現(xiàn)，虎舌紅乙酸乙酯提取物的還原能力和清除自由基的能力強(qiáng)于石油醚、正丁醇及水提取物?？寡趸钚缘脑u(píng)價(jià)方法有多種，如DPPH自由基清除活性測(cè)定、ABTS自由基清除活性測(cè)定以及鐵離子螯合能力測(cè)定，但針對(duì)不同評(píng)價(jià)方法確定抗氧化能力時(shí)，需要一種方法對(duì)抗氧化綜合能力進(jìn)行整體評(píng)價(jià)。層次分析法是美國(guó)運(yùn)籌學(xué)家匹茨堡大學(xué)教授薩蒂提出的一種層次權(quán)重決策分析方法，該方法是將定量分析與定性分析相結(jié)合，使不同指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)確定在一定范圍內(nèi)，避免了主觀因素對(duì)賦予權(quán)重系數(shù)的影響，利用權(quán)數(shù)求出各方案的優(yōu)劣次序，具有強(qiáng)大的科學(xué)客觀性，可以有效解決難以定量分析的問(wèn)題。層次分析法通常被廣泛應(yīng)用于安全科學(xué)研究，且近年來(lái)，層次分析法也逐步應(yīng)用于中藥提取工藝的綜合評(píng)價(jià)[19-20]。但在生物活性評(píng)價(jià)方面應(yīng)用很少，因此，該試驗(yàn)用正丁醇、甲醇、乙醇和水對(duì)貫葉連翹不定根進(jìn)行提取，對(duì)4種不同溶劑提取物的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子螯合能力進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而利用層次分析法對(duì)抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為貫葉連翹不定根提取物作為天然抗氧化劑的深入研究以及相關(guān)抗氧化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

貫葉連翹不定根按照于曉坤[21]的方法進(jìn)行增殖培養(yǎng)。取20 g增殖后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的貫葉連翹不定根(鮮重)，切碎成1 cm大小后接種到裝有4 L培養(yǎng)液(Murashige and Skoog Medium + 吲哚丁酸1.2 mg/L+蔗糖40 g/L)的5 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH值至5.8，暗培養(yǎng)，通氣量為0.1 vvm，控制溫度在(25±2) ℃，培養(yǎng)30 d后，取出培養(yǎng)好的貫葉連翹不定根用水沖洗3～4次，瀝干表面水分，放入45 ℃烘干箱中，烘干的植物干品用作試驗(yàn)材料。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

Murashige and Skoog Medium(MS，索萊寶公司，中國(guó))，吲哚丁酸(IBA，上海源葉生物科技有限公司，中國(guó))，過(guò)硫酸鉀(K2S2O8，科密歐公司，中國(guó))，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，美國(guó))，抗壞血酸(Vc，索萊寶公司，中國(guó))，2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，索萊寶公司，中國(guó))，氯化亞鐵(FeCl2·2H2O，索萊寶公司，中國(guó))。

YHW1103遠(yuǎn)紅外快速干燥箱(長(zhǎng)沙聯(lián)申恒溫有限公司)；JY2003電子天平(西安研碩儀器設(shè)備有限公司)；UV1102紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京格瑞恩科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 貫葉連翹不定根提取物的制備

取干燥的貫葉連翹不定根2 g，置于150 mL三角燒瓶?jī)?nèi)，利用正丁醇、甲醇、乙醇和水4種不同溶劑按液料比30∶1在溫度60 ℃和60 kHz為頻率的超聲波中進(jìn)行提取[17]，經(jīng)過(guò)1 h后過(guò)濾，重復(fù)上述提取操作4次，合并濾液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)真空濃縮，將濃縮后的膏狀物置于烘干箱中45 ℃下干燥至恒重，收集烘干后的不同溶劑提取物，置于-20 ℃冰箱中保存，對(duì)待測(cè)定提取物中總黃酮含量以及抗氧化活性進(jìn)行評(píng)估。

1.3.2 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物中總黃酮含量的測(cè)定

采用李偉等[22]方法測(cè)定總黃酮含量。準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至燒杯內(nèi)，用70%的乙醇溶液充分溶解并定容至250 mL，分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用70%的乙醇溶液定容至2 mL，以70%乙醇為空白對(duì)照，每間隔6 min分別加入0.3 mL的NaNO2(5%)溶液、0.3 mL的Al(NO3)3(10%)溶液和2 mL的NaOH(4%)溶液，搖勻并在510 nm下測(cè)量OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別準(zhǔn)確稱取0.1 g不同溶劑提取物于離心管中，加70%的乙醇溶液沒(méi)過(guò)材料，置于60 ℃水浴鍋加熱3 h后進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的溶液用70%乙醇溶液將其定容至25 mL，每個(gè)樣品液取0.05 mL于試管中，用70%的乙醇定容至2 mL后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，測(cè)定吸光值，并計(jì)算總黃酮的含量。

總黃酮含量/(mg·g-1)=CVD/W,

式中,C為樣品溶液濃度/(mg·g-1)；V為樣品溶液總體積/mL；D為樣品稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.3 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物抗氧化活性的測(cè)定

1) DPPH自由基清除活性的測(cè)定

參照李釗等[23]的方法進(jìn)行DPPH自由基清除試驗(yàn)，并稍作改進(jìn)。分別精密稱取4種不同溶劑提取物40 mg定容至20 mL，樣品濃度2.0 mg/mL，將上述溶液依次稀釋至濃度為0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL的待測(cè)樣品溶液，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。稱取0.003 9 g的DPPH，用甲醇溶液定容至100 mL，即DPPH溶液濃度為0.1 mM。向試管中加入2 mL的待測(cè)樣品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液，設(shè)為待測(cè)樣品組?？瞻讓?duì)照組用2 mL甲醇代替待測(cè)樣品。避光靜置30 min，用紫外分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)定吸光值OD，按照下述公示計(jì)算出DPPH自由基清除率。

式中，OD樣為待測(cè)樣品組吸光值，OD空為空白對(duì)照組吸光值。

2) ABTS自由基清除活性的測(cè)定

參照吳冕等[24]的方法進(jìn)行ABTS自由基清除試驗(yàn)，對(duì)4種不同溶劑提取物清除ABTS自由基的能力進(jìn)行測(cè)定。用去離子水配置2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀和7 mmol/L的ABTS混合溶液，并經(jīng)過(guò)一定的配置成儲(chǔ)備液。試驗(yàn)前需用去離子水將ABTS儲(chǔ)備液的吸光值稀釋至在734 nm下為0.70±0.02。稱量選取50 mg 4種不同溶劑提取物，溶于5 mL的去離子水中，溶液濃度為10 mg/mL。將以上溶液分別稀釋至濃度為0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL的待測(cè)樣品溶液。待測(cè)樣品組取待測(cè)樣品溶液(0.1 mL)和ABTS溶液(3.9 mL)于試管中。待測(cè)樣品對(duì)照組取待測(cè)樣品溶液(0.1 mL)和去離子水(3.9 mL)于試管中?？瞻讓?duì)照組向試管中加入甲醇溶液(0.1 mL)和ABTS溶液(3.9 mL)，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。搖勻后靜置6 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得吸光值(734 nm)，按照下述公示計(jì)算出ABTS自由基清除率。

式中，A樣為待測(cè)樣品組吸光值，A對(duì)為待測(cè)樣品對(duì)照組吸光值，A空為空白對(duì)照組吸光值。

3) 鐵離子螯合能力的測(cè)定

參照Fu等[25]的方法并稍作改進(jìn)，對(duì)4種不同溶劑提取物的鐵離子螯合能力進(jìn)行測(cè)定。稱取4種不同溶劑提取物100 mg溶于5 mL的蒸餾水中，溶液濃度為20 mg/mL。將上述溶液依次稀釋至濃度為0.625、1.25、2.5、5.0、10.0和20.0 mg/mL的待測(cè)樣品溶液，檸檬酸作為陽(yáng)性對(duì)照。按照表1準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品溶液、蒸餾水、FeCl2溶液、菲洛嗪溶液于96孔板中，于室溫中靜置10 min。用酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)吸光值，并計(jì)算出鐵離子螯合能力。

表1 反應(yīng)液的組成

式中，A樣為待測(cè)樣品組吸光值，A對(duì)為待測(cè)樣品對(duì)照組吸光值，A空為空白對(duì)照組吸光值。

1.3.4 抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)模型構(gòu)建

根據(jù)Jensen[26]方法進(jìn)行層次分析法。圖1為層次分析法結(jié)構(gòu)模型，由目標(biāo)層和標(biāo)準(zhǔn)層構(gòu)成，其中,目標(biāo)層為抗氧化能力，標(biāo)準(zhǔn)層分別為DPPH自由基清除能力(f1)、ABTS自由基清除能力(f2)和鐵離子螯合能力(f3)。

表2為各指標(biāo)成分的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[27]，對(duì)不同抗氧化能力進(jìn)行兩兩比較后主觀評(píng)價(jià)出相對(duì)重要性。

表2 各指標(biāo)評(píng)分標(biāo)注

根據(jù)公式(1)建立不同抗氧化能力成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣(N)并進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，并利用公式(2)計(jì)算出初始權(quán)重(Wi'),利用公式(3)計(jì)算出歸一化權(quán)重(Wi)。

(1)

(2)

(3)

根據(jù)公式(4)計(jì)算出判斷矩陣的最大特征值(λmax)與，根據(jù)公式(5)計(jì)算出一致性指數(shù)(CI)，利用公式(6)計(jì)算出CI的成對(duì)矩陣的一致性比率CR，并利用隨機(jī)一致性指數(shù)RI(表3)評(píng)估矩陣合理性。最后利用公式(7)和3種抗氧化評(píng)價(jià)中的半數(shù)有效濃度(EC50)計(jì)算出綜合評(píng)分S[28]。根據(jù)S值綜合評(píng)價(jià)抗氧化活性。

表3 隨機(jī)一致性指數(shù)

(4)

(5)

(6)

(7)

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用鄧肯氏新復(fù)極差法作對(duì)比，顯著水平為P<0.05，每個(gè)處理均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物中總黃酮含量

貫葉連翹不定根4種不同溶劑提取物中總黃酮含量差異顯著。甲醇提取物中的總黃酮含量最高，達(dá)到296.31 mg/g，乙醇和正丁醇提取物中的總黃酮含量無(wú)顯著差異，當(dāng)提取溶劑為水時(shí)，貫葉連翹不定根的總黃酮含量?jī)H有45.73 mg/g(圖2)。

2.2 貫葉連翹不定根不同提取溶劑的抗氧化活性

2.2.1 清除DPPH自由基能力

由圖3可知，4種不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基都有顯著的清除能力。其中，甲醇提取物表現(xiàn)出最高的清除能力，當(dāng)濃度為0.40 mg/mL時(shí)，清除率最高達(dá)到了93.36%。乙醇提取物和正丁醇提取物清除能力較甲醇提取物稍低，在濃度為0.40 mg/mL時(shí)，清除率為92.38%和86.77%，而水提物最弱。

2.2.2 清除ABTS自由基能力

由圖4可知，ABTS清除率隨提取物濃度(0～1.0 mg/mL)的增加而上升。乙醇提取物有最強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，當(dāng)濃度為4.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到99.12%，但比陽(yáng)性對(duì)照Vc的清除能力(100%)稍低。甲醇提取物對(duì)ABTS自由基清除能力稍弱于乙醇提取物，當(dāng)濃度為4.0 mg/mL時(shí)，清除率為96.52%，水提取物仍為最弱。

2.2.3 不同溶劑提取物的鐵離子螯合能力

由圖5可知，4種不同溶劑提取物均是良好的鐵離子螯合劑。鐵離子螯合能力與提取物濃度呈正相關(guān)。其中，正丁醇提取物增強(qiáng)最為顯著，當(dāng)濃度達(dá)到20.0 mg/mL時(shí)，鐵離子螯合能力達(dá)到73.29%，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照檸檬酸(65.85%)，其中甲醇提取物鐵離子螯合能力最弱，在濃度為20.0 mg/mL時(shí)，僅有63.43%。

2.2.4 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物抗氧化能力比較

由表4的EC50值可以看出，不定根的不同溶劑提取物皆有一定的抗氧化活性，乙醇和甲醇提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，而正丁醇提取物則具有較好的鐵離子螯合能力，而水提取物在3組試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較弱的抗氧化能力。

表4 不同溶劑提取物抗氧化能力比較

2.3 抗氧化綜合能力評(píng)價(jià)

利用層次分析法計(jì)算DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子螯合能力的成對(duì)比較矩陣各指標(biāo)權(quán)重和綜合能力，結(jié)果見(jiàn)表5，標(biāo)準(zhǔn)層權(quán)重系數(shù)為Wi=[0.443 0.387 0.169]，一致性指標(biāo)CI = 0.009，隨機(jī)一致性比率CR=0.016<0.1，表明各因素的權(quán)重符合條件，所有矩陣一致性合理。

表5 層次分析結(jié)構(gòu)模型中成對(duì)比較矩陣及各抗氧化能力權(quán)重

由于貫葉連翹不定根水溶劑提取物的抗氧化能力較低，所以根據(jù)表5的權(quán)重只計(jì)算貫葉連翹不定根的正丁醇提取物、甲醇提取物、乙醇提取物的抗氧化能力綜合評(píng)分(最低評(píng)分的提取物抗氧化綜合能力最強(qiáng))(圖6)。正丁醇提取物的抗氧化綜合評(píng)分為1.469，甲醇提取物綜合評(píng)分為1.360，乙醇提取物綜合評(píng)分為0.975，因此，乙醇提取物的抗氧化綜合能力最強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

天然綠色抗氧化劑可絡(luò)合促氧化的金屬離子，有效抑制自由基的產(chǎn)生，促進(jìn)抗氧化酶和抗氧化因子的產(chǎn)生，如Gao等[29]研究發(fā)現(xiàn)，綠茶不僅有較強(qiáng)的自由基清除能力，而且也有很好的絡(luò)合鐵離子的能力；吳亞楠等[30]發(fā)現(xiàn)，玉米須的DPPH自由基清除能力很強(qiáng)，起到很好的抗氧化作用，可進(jìn)一步應(yīng)用在醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)中。就貫葉連翹而言，葛莉等[31]研究了不同收獲期貫葉連翹花中抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)在處于花蕾期至盛花期時(shí)花器官抗氧化能力較強(qiáng)。貫葉連翹不定根培養(yǎng)已有一些研究報(bào)道，但對(duì)培養(yǎng)的不定根是否具有抗氧化能力至今尚未報(bào)道。該研究發(fā)現(xiàn)，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的貫葉連翹不定根4種不同溶劑提取物的抗氧化能力均隨著提取物濃度的升高而增強(qiáng)，最高的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子螯合能力分別出現(xiàn)在甲醇、乙醇和正丁醇提取物中?？梢?jiàn)，用不同評(píng)價(jià)方法測(cè)定的最高抗氧化能力會(huì)因提取溶劑而不同[32]。面對(duì)這種不同抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)所出現(xiàn)的不同結(jié)果，如何進(jìn)行綜合評(píng)估就成為提取工藝及進(jìn)一步的產(chǎn)品生產(chǎn)所面臨的問(wèn)題。而將層次分析的多指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)應(yīng)用在不同評(píng)價(jià)指標(biāo)或無(wú)結(jié)構(gòu)特性的復(fù)雜問(wèn)題中是一種清晰明了的方法，并且在每個(gè)層次中的每個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響程度都是量化的，既考慮了研究人員對(duì)每項(xiàng)指標(biāo)的關(guān)注程度，又考慮了每項(xiàng)指標(biāo)本始數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，這使整體評(píng)價(jià)效果更加正當(dāng)和科學(xué)[33]。該試驗(yàn)利用層次分析法對(duì)貫葉連翹不定根抗氧化綜合能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到正丁醇、甲醇、乙醇提取物的綜合評(píng)分，分別為1.469、1.360和0.975，表明乙醇提取物的抗氧化綜合能力最強(qiáng)，因此，貫葉連翹不定根用于抗氧化相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)，建議以乙醇作為溶劑進(jìn)行提取。通過(guò)該研究可知，層次分析法是可用于對(duì)抗氧化能力的多種指標(biāo)權(quán)重進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的一種理想途徑，對(duì)于促進(jìn)抗氧化相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)與應(yīng)用發(fā)展具有實(shí)質(zhì)性的重要意義。