李俊杰， 趙 洋， 哈 洋， 蘇喆瑩， 王景然， 全雪麗， 吳松權(quán)*

(1.延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133000；2.臺頭鎮(zhèn)人民政府，山東 壽光 262735)

黃芪，又稱黃耆、綿芪，是豆科黃芪屬植物，主要分布在我國內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江、寧夏、吉林等北方地區(qū)[1]，作為臨床常用中藥，藥用歷史久遠[2]。黃芪最早見于我國的《神農(nóng)本草經(jīng)》，李時珍在《本草綱目》中將其稱之為黃芪，味甘，氣微溫，主入歸肺、脾二經(jīng)，具有補氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫、托毒生肌之功效[3-5]?！吨腥A人民共和國藥典》中規(guī)定正品黃芪為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge. var.mongholicus(Bunge.) Hsiao)和膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge)的干燥根[6]。

CBF(C-repeatbindingfactor)是低溫響應(yīng)基因，在植物響應(yīng)低溫和調(diào)控途徑中起著十分重要的作用,同時在不同植物物種對脅迫的響應(yīng)中也發(fā)揮著不同的作用，有部分學者發(fā)現(xiàn)，CBF也能對其他非生物脅迫和激素作出反應(yīng)，如高溫、干旱、鹽和脫落酸等[7-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CBF基因在不同植物抗凍性調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。當植物感受到低溫信號時，CBF會快速進行響應(yīng)，并結(jié)合到冷應(yīng)答基因的啟動子區(qū)域激活它們的轉(zhuǎn)錄表達[12-13]。該試驗旨在了解膜莢黃芪中CBF基因的結(jié)構(gòu)及其在低溫與干旱脅迫條件下的表達量變化，為進一步研究CBF基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料

膜莢黃芪種植于延邊大學農(nóng)學院試驗基地。不定根誘導采用李子羊等[14]的方法。待不定根長出后，利用B5+IBA(2 mg/L)培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)，之后分別在4 ℃低溫脅迫和15% PEG干旱脅迫條件下處理0、2、4 h并迅速置于液氮中冷凍，將處理后的樣品保存于-80 ℃冰箱備用，重復3次。

1.1.2 試劑

SMARTerTMRACE cDNA5′-RACE和3′-RACE試劑盒，購自Clontech公司；Trizol試劑，購自Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自 Toyobo公司；SYBRPremix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)熒光定量試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和PMD19-T載體，購自大連Takara公司。

1.1.3 主要儀器

DW-86L828超低溫保存冰箱(Haier公司)、MJ-78A高壓滅菌鍋(上海施都凱公司)、T100TMThermal Cycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)、干燥箱(上海施都凱公司)、高速冷凍離心機(Hitachi)、超微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000 C)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成

采用Trizol一步法提取總 RNA，使用超微量分光光度計測定其濃度及吸光值；依據(jù)測定值計算并稀釋RNA的濃度到500 ng/μL，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗。將所提取的RNA放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。以提取的膜莢黃芪的RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟合成cDNA的第1條鏈。

1.2.2 設(shè)計CBF基因的簡并引物

用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的GeneBank數(shù)據(jù)庫，搜索并下載已經(jīng)收錄在內(nèi)的擬南芥、大豆等植物的膜莢黃芪CBF基因(AmCBF)的同源序列。利用多序列比對軟件MEGA7進行比對，分析并確定CBF基因的保守區(qū)域。利用引物設(shè)計軟件Primer Premier5.1設(shè)計CBF基因的簡并引物，分別命名為AmCBF-ju1、AmCBF-jd1，引物的序列如表1所示。

1.2.3CBF基因保守區(qū)的克隆

以合成的cDNA第1條鏈為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μL：10×PCR Buffer2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，cDNA模板1 μmol/L，2.0 μL，上游引物AmCBF ju1 2.0 μL，下游引物AmCBF jd1 2.0 μL，5 U ExTaq酶0.2 μL，剩余用ddH2O補足。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，參照回收試劑盒說明書對DNA凝膠進行回收，參照T載體說明書連入 PMD-19T載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)JM109，通過對藍色和白色的菌落進行篩選，白色菌落即是成功的轉(zhuǎn)化子。將提取的重組質(zhì)粒DNA 原液稀釋50倍后，使用M13引物(表 1)進行PCR檢測。對檢測為陽性的克隆菌株進行測序，測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.4 5′-RACE和3′-RACE擴增

參考SMARTerTMRACE cDNA 5′-RACE和3′-RACE試劑盒的說明書進行，根據(jù)目的基因保守序列的測序結(jié)果設(shè)計5′-RACE和3′-RACE特異引物，設(shè)計的引物序列如表1所示。PCR得到的產(chǎn)物按照步驟1.2.3進行回收、連接、轉(zhuǎn)化并測序。

1.2.5CBF全長CDS的克隆

利用DNAstar軟件對克隆所得到的基因保守序列以及5′-RACE和3′-RACE產(chǎn)物序列進行拼接分析，從而得到2個基因的全長序列。根據(jù)拼接的基因全長序列設(shè)計全長特異引物(表1)，驗證基因的全長編碼信息。

表1 引物序列

1.2.6 生物信息學分析

檢索同源性氨基酸序列采用在線工具BLAST；分析基因的開放閱讀框(ORF)采用Lasergene軟件包中的EditSeq；預測編碼蛋白的分子量和等電點等理化性質(zhì)采用ExPASyProtParam服務(wù)器；利用ExPASyProtScale服務(wù)器分析蛋白疏水性；預測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)用在線工具TMHMM-2.0；預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)采用 SOPMA服務(wù)器，預測亞細胞定位情況采用在線工具TargetP1.1和WoLF PSORT；預測信號肽采用在線工具SignalP 5.0；利用MEGA7軟件進行氨基酸序列比對分析以及構(gòu)建CBF氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.7 膜莢黃芪CBF熒光定量PCR分析

根據(jù)獲得的AmCBF的特異序列設(shè)計1對熒光定量PCR引物(表 1)，所用內(nèi)參基因為黃芪18S基因(Genbank登陸號為 AF359594，表 1)。以標準的AmCBF和18S基因拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的 CT 值為縱坐標，繪制各自的標準曲線。根據(jù)未知樣品的 CT 值，即可在各自標準曲線中得到樣品的拷貝數(shù)，再求出相對于內(nèi)參基因18S的相對表達量。每組樣品進行 3 次重復檢測。

1.2.8 統(tǒng)計分析

AmCBF基因表達量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析利用SPSS 19.0軟件進行，個體差異利用Duncan多范圍檢驗進行評估(P<0.05)，用標準差來代表誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmCBF基因全長cDNA克隆與序列分析

使用表1中設(shè)計的簡并引物AmCBF-ju1和AmCBF-jd1進行PCR擴增試驗。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接、轉(zhuǎn)化和M13鑒定等操作，將最后得到的鑒定產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其過程中的相關(guān)圖片如圖1所示。PCR擴增后，膜莢黃芪基因CBF的片段長度約為240 bp。測序后，基因AmCBF的保守區(qū)域長度為230 bp，并將其命名為AmCBF-RT。

使用NCBI主頁的BLAST功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.)對克隆得到的AmCBF-RT基因保守區(qū)進行同源性檢測比較。其結(jié)果顯示，膜莢黃芪CBF與豆科植物苜蓿(AC166046.15)、木豆(XM020350729.1)CBF基因的相似度分別為83%和86%。因此，初步認定克隆到的AmCBF是膜莢黃芪CBF基因的1個片段。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成的第1條鏈，用表1中設(shè)計的特異性引物進行5′-RACE和3′-RACE的 PCR擴增實驗。其過程中的PCR結(jié)果電泳圖以及鑒定圖如圖2所示。

測序回來的結(jié)果顯示，AmCBF基因5’序列的長度為572 bp，通過BLAST進行同源性檢測分析，結(jié)果顯示與豆科植物木豆(XM020350729.1)、赤豆(XM017585861.1)的序列相似性分別是87%和87%，因此，初步確定所得到的AmCBF基因5’是膜莢黃芪CBF基因的5’端；AmCBF基因3’序列的長度為425 p，通過BLAST進行同源性檢測分析，結(jié)果顯示與豆科植物苜蓿(XM003611110.2)、鷹嘴豆(XM004511547.2)的序列相似性分別是78%和78%，因此，初步確定所得到的AmCBF基因3’是膜莢黃芪CBF基因的3’端。

將5′-RACE和3′-RACE測序結(jié)果進行比對并拼接，從而得到理論上AmCBF基因的全長序列。分別設(shè)計基因的全長引物(表1)。以膜莢黃芪總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增試驗。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 PCR鑒定結(jié)果顯示與PCR擴增所得目的條帶長度一致(圖3)。故確定其為基因AmCBF的全長，并命名為AmCBF-cds。

2.2 AmCBF生物信息學分析

對AmCBF基因的全長序列進行分析(圖4)。圖中方框表示基因編碼的起始密碼子和終止密碼子。AmCBF全長827 bp，其中，包括642 bp的開放閱讀框(ORF)，54 bp的5’非翻譯區(qū)(5′-UTR)，131 bp的3′非翻譯區(qū)，其中包含25 bp的Poly尾；其A+T的含量為61.9%，G+C的含量為38.1%。

使用NCBI中的BLAST功能對AmCBF進行同源性檢測，結(jié)果顯示其與豆科植物狹葉羽扇豆(CP023126.1)的同源性為82%，并與其他豆科植物的CBF基因相似性也較高。初步證實該試驗所克隆的CBF基因是膜莢黃芪CBF基因的序列。

對AmCBF所編碼的蛋白質(zhì)序列進行分析。結(jié)果顯示AmCBF蛋白編碼213個氨基酸，這與其它植物CBF蛋白編碼氨基酸結(jié)果相似[15-16]。分子式為C1040H1632N308O331S10，分子量為24 066.86 Da，其理論等電點為5.84。該蛋白質(zhì)中酸性氨基酸有31個，堿性氨基酸有27個，說明該蛋白質(zhì)呈酸性，而且其不穩(wěn)定系數(shù)為71.21，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水指數(shù)為-0.758，表明該蛋白為親水性蛋白(圖 5)，與山葡萄VaCBF3[17]生物信息學分析結(jié)果一致。亞細胞定位顯示，位于細胞核和細胞質(zhì)的可能性較大，預測概率分別為56.5%和21.7%，并且不存在信號肽?？缒そY(jié)構(gòu)分析的預測結(jié)果顯示，AmCBF沒發(fā)現(xiàn)交匯區(qū)域，因此該基因所編碼的蛋白都是非跨膜蛋白。與RcCBF[18]跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，RcCBF蛋白也沒有跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白。

通過使用PRABI在線分析軟件對基因AmCBF預測編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖6所示。AmCBF基因蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含29個α折疊，44個β折疊以及140個無規(guī)則延伸構(gòu)成，分別占據(jù)13.62%、20.66%和65.73%。

為了深入研究AmCBF和其他物種CBF的進化關(guān)系，運用分析軟件MEGA7構(gòu)建CBF基因與其他不同物種CBF基因的進化樹(圖7)，AmCBF與豆科植物木豆(Cajanuscajan)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)的CBF歸為Type Ⅱ，大豆(Glycinesoja)、毛豆(Glycinemax)、決明子(Sennatora)、黧豆(Mucunapruriens)的CBF歸為Type Ⅰ，榴蓮(Duriozibethinus)、蓖麻(Ricinuscommunis)、甜瓜(Cucumismelo)的CBF歸為Type Ⅲ，白梨(Pyrusxbretschneideri)、海棠(Malussieversii)、梅花(Prunusmume)、杏(Prunusarmeniaca)的CBF歸為Type Ⅳ。

進一步驗證AmCBF在低溫下的表達(圖8)，在低溫和干旱脅迫條件處理下，AmCBF表達量趨勢相似，均為先上升后下降。且在脅迫處理2 h后，AmCBF表達量顯著上升，在處理時間達到4 h后，基因表達水平均呈下降趨勢，但其表達量仍與對照組有顯著性的差異。綜合分析表明，AmCBF在低溫和干旱的脅迫處理條件下都能被誘導表達，且低溫處理條件下表達量高于干旱處理，并且發(fā)現(xiàn)它們誘導表達的時間存在一定差異。

3 討論與結(jié)論

CBF在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和外界環(huán)境響應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[19]，目前為止，學者們從擬南芥、番茄、大豆、葡萄等植物中克隆到了CBF基因并通過研究發(fā)現(xiàn)其有調(diào)節(jié)植物抗冷能力的作用[20-22]。在低溫下植物細胞內(nèi)的自由水減少，間接對植物造成干旱等逆境傷害。因此，抗冷和抵御干旱等逆境脅迫有密不可分的聯(lián)系，CBF家族的部分成員對干旱逆境誘導也有響應(yīng)[23]。該研究采用同源克隆法和RACE技術(shù)在膜莢黃芪中克隆得到了CBF基因，并分別在低溫和干旱脅迫條件下處理0、2、4 h。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，在2 h后表達量最高，4 h后表達量有所下降，且低溫脅迫時表達量高于干旱脅迫。已有研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，CBF基因都具有瞬時表達特性。CBF基因在低溫脅迫下短時間內(nèi)即被強烈誘導并表達，但隨著時間推移，誘導作用逐漸減弱[24]。如擬南芥CBF1、棉花GhDREB1基因的表達在2 h后達到表達高峰[25-26]；黑麥草CBF的表達高峰為2～4 h[27]。這與該試驗結(jié)果一致，初步認定克隆得到的CBF基因是膜莢黃芪的基因序列。該研究中膜莢黃芪CBF基因的克隆和表達分析為CBF基因低溫調(diào)控途徑研究和抗寒分子機制研究奠定了基礎(chǔ)。