黃慧，孫煜，何虹，盧日剛

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530022)

復(fù)方黃藤洗液具有清熱解毒，殺蟲止癢的功效,主要用于濕熱帶下(外陰炎，陰道炎)和皮膚瘙癢等癥的輔助治療，其處方由牛白藤、漆大姑、梔子、黃芩、土茯苓、白及、蛇床子、黃藤、桉油、冰片、醋酸氯己定組成，并加入苯甲酸鈉和羥苯乙酯作防腐劑。黃藤是我國傳統(tǒng)中藥,其有效成分鹽酸巴馬汀具有抗炎、抑菌等作用[1]，黃芩苷為方中黃芩的主要有效成分，其藥理作用廣泛，包括抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[2]。醋酸氯己定作為常用抗菌劑或消毒劑,具有很強(qiáng)的抑菌作用和較好的殺菌效果，并且有研究證明含醋酸氯己定成分的洗液在婦科炎癥的治療中療效顯著[3-4]。

處方中苯甲酸鈉和羥苯乙酯是常用的化學(xué)防腐劑，均對(duì)人體有一定毒性，用量過多可能危害人體健康，導(dǎo)致患者出現(xiàn)皮膚刺激或過敏，羥苯酯類的過量使用還可能有類激素作用，增加乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)[5]；而用量不足，防止微生物污染的能力不足，又可能導(dǎo)致藥品霉變、酸敗，直接影響藥物的產(chǎn)品質(zhì)量和用藥安全[6]。

復(fù)方黃藤洗液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了鹽酸巴馬汀含量的測定方法，尚未見同時(shí)測定復(fù)方黃藤洗劑中鹽酸巴馬汀、黃芩苷和醋酸氯己定3個(gè)成分的報(bào)道，也未見對(duì)其防腐劑的研究。為有效控制藥品質(zhì)量，保證其療效，本研究在參考文獻(xiàn)[7-9]的基礎(chǔ)上，采用 HPLC 同時(shí)測定復(fù)方黃藤洗劑中3個(gè)有效成分(鹽酸巴馬汀、黃芩苷和醋酸氯己定)及2種防腐劑(苯甲酸鈉、羥苯乙酯)含量，為復(fù)方黃藤洗劑標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS205DU電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀(含 DAD 檢測器，美國賽默飛世爾公司)；Milli-Q A10超純水機(jī)(美國密理博公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-202122，含量：94.2%，)、苯甲酸鈉對(duì)照品(批號(hào)：100433-201702，含量：99.7%)、鹽酸巴馬汀對(duì)照品(批號(hào)：110732-201913，含量：85.7%)、醋酸氯己定對(duì)照品(批號(hào)：100183-201604，含量：96.3%)、羥苯乙酯對(duì)照品(批號(hào)：100847-201604，含量：99.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(德國默克公司，色譜純，批號(hào)：JA090630)；三乙胺(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：20190130)；磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：201881109)；復(fù)方黃藤洗液(廣西德聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)：20200403、20200404、20200405)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Xbridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；0.01 mol·L-1磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g，加800 mL水溶解，加入5 mL三乙胺，再加水稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.80)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，流速為1.0 mL·min-1；待鹽酸巴馬汀出峰后，立即按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為230、259、274 nm，其中230 nm檢測苯甲酸鈉，259 nm 檢測醋酸氯己定、羥苯乙酯，274 nm檢測黃芩苷、鹽酸巴馬汀。進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 稱取各對(duì)照品適量，置于量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為各對(duì)照品儲(chǔ)備液(各組分質(zhì)量濃度分別為黃芩苷0.192 3 mg·mL-1、鹽酸巴馬汀0.412 0 mg·mL-1、醋酸氯己定0.207 2 mg·mL-1、苯甲酸鈉1.626 3 mg·mL-1、羥苯乙酯0.206 2 mg·mL-1)。精密量取各組分對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.5 mL，置于同一20 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品搖勻，精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 稀釋液的制備 稀釋液為0.01 mol·L-1磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g，加800 mL水溶解，加入5 mL三乙胺，再加水稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.80)-乙腈(75∶25)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及溶劑空白，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定并記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，供試品溶液中各成分在對(duì)照品相同保留時(shí)間處均有相應(yīng)的色譜峰，且溶劑空白無干擾，在該色譜條件下，黃芩苷、鹽酸巴馬汀、醋酸氯己定、苯甲酸鈉、羥苯乙酯與其他成分均可達(dá)到基線分離，分離度均>1.5，具有良好的分離效果。用 DAD檢測器進(jìn)行峰純度檢查，純度因子均滿足閾值限值要求(閾值為990)。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下各組分對(duì)照品儲(chǔ)備液，用稀釋劑稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行測定。分別以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，各組分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見表2)。

表2 各組分線性關(guān)系

2.3.3 密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定6次，測定峰面積，以峰面積考察精密度，黃芩苷、鹽酸巴馬汀、醋酸氯己定、苯甲酸鈉、醋酸氯己定、峰面積RSD分別為0.13%、0.09%、0.10%、0.13%、0.10%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品(批號(hào)：20200403)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果黃芩苷的平均含量為0.23 mg·mL-1，RSD為0.7%(n=6)，鹽酸巴馬汀的平均含量為0.57 mg·mL-1，RSD為0.4%(n=6)，醋酸氯己定峰的平均含量為0.22 mg·mL-1，RSD為0.4%(n=6)，苯甲酸鈉的平均含量為1.88 mg·mL-1，RSD為0.6%(n=6)，羥苯乙酯的平均含量為0.21 mg·mL-1，RSD為0.4%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：20200403)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，在0、2、5、8、12、16、20、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，測得黃芩苷、鹽酸巴馬汀、醋酸氯己定、苯甲酸鈉、羥苯乙酯峰面積RSD分別為0.3%、0.3%、0.3%、0.4%、0.3%、0.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率試驗(yàn)方法，取同一批供試品(批號(hào)：20200403)1.5 mL 9份，每3份平行，分別置50 mL量瓶中，按對(duì)照品加入量約相當(dāng)于所取供試品中待測組分量的50%、100%、150%分別精密加入各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，并加稀釋劑定容至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

2.3.7 樣品含量測定結(jié)果 取樣品3批，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行測定，另取對(duì)照品溶液同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各組分含量測定結(jié)果

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 討論

3.1 波長的選擇 結(jié)合高效液相色譜檢測得到的5種成分 DAD 紫外吸收?qǐng)D譜，在該色譜條件下，黃芩苷在274、344 nm的波長處有最大吸收，鹽酸巴馬汀在227、274、344 nm的波長處有最大吸收，醋酸氯己定在232、259 nm的波長處有最大吸收，苯甲酸鈉在274、344 nm的波長處有最大吸收，羥苯乙酯在274、344 nm的波長處有最大吸收。為使各組分的檢測均有較大的吸收，最終選定230、259和 274 nm 作為測定波長。其中，230 nm作為苯甲酸鈉的檢測波長；259 nm 作為醋酸氯己定及羥苯乙酯的檢測波長；274 nm 作為黃芩苷及鹽酸巴馬汀的檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇 比較了不同品牌色譜柱Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Kromasil 100A C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)的使用情況，二者均能有效分離各組分，各組分出峰順序稍有差異，但均能達(dá)到基線分離，分離度均符合要求，各組分峰形也較好。

4 結(jié)論

本研究建立的高效液相色譜法能夠有效分離并同時(shí)測定復(fù)方黃藤洗劑中3個(gè)有效成分(鹽酸巴馬汀、黃芩苷和醋酸氯己定)及防腐劑(苯甲酸鈉、羥苯乙酯)含量，方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，為更全面的控制本品種的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。