于丹，張慧

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

茅蒼術(shù)是指菊科植物茅蒼術(shù)(RhizomaAreactylodisLanceae)的干燥根莖；據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版記載：其味微甘、辛、苦，性溫；歸脾、胃、肝經(jīng)；具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目的功效；用于治療濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫等[1]?，F(xiàn)代藥理作用表明茅蒼術(shù)具有抗?jié)儯种莆杆岬姆置?，控制胃組織中的炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)，促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)和增加胃黏膜血流量等作用，臨床經(jīng)常用于抗胃潰瘍等消化道系統(tǒng)疾病[2-3]。

根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：中藥在治療疾病過程中，具有多成分作用于多靶點(diǎn)，同時(shí)調(diào)控多通路的特點(diǎn)。而目前關(guān)于茅蒼術(shù)治療胃潰瘍的機(jī)制研究，主要基于Okabe法以及HE染色法觀察胃組織病理的變化；并通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清及胃組織內(nèi)胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(GAS)、炎癥因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量等[4-5]。但此機(jī)制研究方法無法具體體現(xiàn)茅蒼術(shù)何種入血成分發(fā)揮作用；而現(xiàn)有針對(duì)茅蒼術(shù)入血成分質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)，又基本旨在找到其炮制品與生品入血成分的區(qū)別[6-7]，并從未將入血成分與靶點(diǎn)和通路聯(lián)系起來；鑒于上述內(nèi)容，本研究通過超高效液相色譜與四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)對(duì)蒼術(shù)的入血成分進(jìn)行定性分析，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過網(wǎng)絡(luò)的分析、篩選等技術(shù)揭示了“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，打破了文獻(xiàn)相關(guān)單一的研究模式[8]，對(duì)蒼術(shù)治療胃潰瘍的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的分子作用機(jī)制進(jìn)行探索，找到其主要起效成分、主要作用靶點(diǎn)和通路，為推進(jìn)臨床合理用藥提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS；KQ250DB型超聲波清洗器；FD-1A-55冷凍干燥機(jī)；高速離心機(jī)；TGL-16B低速臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 藥材與試劑 茅蒼術(shù)經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張慧教授鑒定為菊科植物茅蒼術(shù)(RhizomaAreactylodisLanceae)的干燥根莖；甲醇(質(zhì)譜純，德國(guó)默克集團(tuán))；乙腈(質(zhì)譜級(jí)，F(xiàn)isher)；純凈水(娃哈哈)；甲酸(德國(guó)默克股份兩合公司)；甲醇(分析純，科密歐)。

1.3 動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重170～190 g，遼寧長(zhǎng)生生物提供。

2 方法

2.1 大鼠體內(nèi)入血成分分析

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱(2.1 mm×50 mm)；A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相(0～20 min，5%A～100%A)，梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)使用負(fù)離子模式；干燥氣體流速11 L·min-1；毛細(xì)管電壓4 V；干燥氣體溫度350 ℃；霧化器氣壓35 psi；毛細(xì)管電壓3.5 kV;碎片電壓380 V；質(zhì)譜采集范圍從100～3 000 m/z。

2.1.3 供試品溶液的制備 取蒼術(shù)粉末8 g，加甲醇1 L，超聲提取1 h，超聲結(jié)束后過濾，濾液經(jīng)過減壓濃縮成浸膏，加水溶解冷凍放置24 h后冷凍干燥，既得。

2.1.4 血清樣品的采集 取大鼠12只(SD級(jí))，共分為兩組(每組6只)，分別為空白組和蒼術(shù)組。以劑量為1 g·kg-1(藥材)灌胃給藥，空白組灌胃同等劑量的生理鹽水。分別在給藥后30 min、60 min進(jìn)行眼眶靜脈取血，4 ℃下靜置30 min后，3 000 r·min-1低速離心15 min，取上清液1 mL，加4倍量的乙腈，迅速渦旋3 min，10 000 r·min-1高速離心10 min，取上清40 ℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL的甲醇，10 000 r·min-1高速離心5 min,過濾得到血清樣品。

2.1.5 大鼠血清入血成分分析 分析一級(jí)圖譜和二級(jí)圖譜碎片離子峰并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)色譜峰進(jìn)行定性鑒別，對(duì)比蒼術(shù)藥材和含藥血清的保留時(shí)間，確定入血成分。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析抗胃潰瘍作用機(jī)制

2.2.1 入血成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction(http://www.swis-s target-prediction.ch/predic-t.php)對(duì)鑒定的茅蒼術(shù)入血成分進(jìn)行蛋白靶標(biāo)獲取，然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中UniProt KB檢索功能對(duì)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行逐一檢索，對(duì)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)的基因名稱轉(zhuǎn)換，獲取蒼術(shù)入血成分的作用靶點(diǎn)。

2.2.2 胃潰瘍作用靶點(diǎn)獲取 以“gastric ulcer”為檢索詞，在Gene Cards數(shù)據(jù)(http://www-genecards.org/)進(jìn)行檢索，獲取胃潰瘍作用靶點(diǎn)。利用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.e-s/tools/venny/index.html)在線工具，獲得蒼術(shù)與胃潰瘍共同作用靶點(diǎn)，即是蒼術(shù)治療胃潰瘍的作用靶點(diǎn)。

2.2.3 靶點(diǎn)蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將共同作用靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)“Multipleproteins”檢索框中，蛋白種類設(shè)置為“homosapiens”，其他參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并通過Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化。

2.2.4 GO和KEGG富集分析 利用Matascape(https://metascape.org/gp/index.html)對(duì)共同作用靶點(diǎn)分別進(jìn)行生物過程、細(xì)胞組分和分子功能的GO分析和KEGG富集分析。

2.2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度值最高的5個(gè)靶點(diǎn)，認(rèn)為這5個(gè)靶點(diǎn)是藥物治療胃潰瘍疾病的核心靶點(diǎn)基因。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到入血成分的mol2化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)獲取找到相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，再利用Pymol軟件除去靶點(diǎn)蛋白上的小分子，最后通過Auto Dock1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體內(nèi)入血成分 分析一級(jí)圖譜和二級(jí)圖譜碎片離子峰并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)色譜峰進(jìn)行定性鑒別，通過對(duì)比含藥血清(見圖1)、藥材(見圖2)、空白血清(見圖3)中各成分的保留時(shí)間一級(jí)譜圖信息，以及其精確分子量，碎片離子峰，最終鑒別出9個(gè)成分，分別是漢黃芩苷、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯 Ⅰ、白術(shù)內(nèi) Ⅱ、白術(shù) Ⅲ、β-桉葉醇、蒼術(shù)素、棕櫚酸、酪氨酸。茅蒼術(shù)的負(fù)離子模式下的分子離子峰鑒別見表1。

表1 茅蒼術(shù)分子離子峰鑒別(負(fù)離子)

圖1 含藥血清UPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖

圖2 茅蒼術(shù)藥材UPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖

圖3 空白血清UPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖

3.2 蒼術(shù)入血成分靶點(diǎn)的獲取以及網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蒼術(shù)入血成分的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，未在TCMSP找到靶點(diǎn)的成分，通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。將入血成分和靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件形成網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。茅蒼術(shù)入血成分的MOL ID以及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)見表2。

圖4 入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 茅蒼術(shù)入血成分及其靶點(diǎn)

3.3 交集靶點(diǎn)及相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用在線Venn2.1分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲得入血成分的靶點(diǎn)和胃潰瘍疾病靶點(diǎn)的交集，并繪制Venn圖(見圖5)。將交集靶點(diǎn)輸入string(http://string-db.org/)網(wǎng)站，“mediumcofidence”大于0.4，隱藏一個(gè)游離靶點(diǎn)，其余為默認(rèn)值。將其數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，最終得到其PPI網(wǎng)絡(luò)圖。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有19個(gè)節(jié)點(diǎn)(去除1個(gè)獨(dú)立節(jié)點(diǎn))，70條邊，degree值越大節(jié)點(diǎn)越大(見圖6)。

圖5 入血成分靶點(diǎn)-胃潰瘍疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖6 茅蒼術(shù)與胃潰瘍交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 通路富集分析結(jié)果 利用matascape(https://metascape.org/gp/index.html)對(duì)共同作用靶點(diǎn)分別進(jìn)行細(xì)胞組分(CC)、生物過程(BP)和分子功能(MF)GO分析(見圖7)，主要涉及蛋白酶結(jié)合(protease binding)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)、蛋白質(zhì)二聚化活性(protein homodimerization activity)、受傷反應(yīng)(response to wounding)、多細(xì)胞機(jī)體穩(wěn)態(tài)(multicellular organismal homeostasis)、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)(regulation of cell adhesion)、膜筏(membrane raft)、 頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)和KEGG富集分析(見圖8)，包括P13K-AKT信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、鞘脂信號(hào)通路(Sphingolipid signaling pathway)、結(jié)核(Tuberculosis)。

圖7 GO富集分析

圖8 KEGG富集分析

3.5 分子對(duì)接結(jié)果 采用AutoDock軟件對(duì)“成分-靶點(diǎn)”中相關(guān)度前5的主要入血成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中自由度較高的前5個(gè)重要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接分子對(duì)接顯示蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)素與5個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合自由能均小于-4 kcal·mol-1(見表3)。

表3 活性成分-靶點(diǎn)結(jié)合能

4 討論

現(xiàn)有研究表明胃潰瘍是由于胃黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和壞死性病變，進(jìn)而導(dǎo)致胃潰瘍[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采UPLC-Q-TOF-MS方法，共鑒別出茅蒼術(shù)9個(gè)原型入血成分，分別為蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、β-桉葉醇、酪氨酸、棕櫚酸。包括烯炔類、倍半萜類、酯類成分、有機(jī)酸等；通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索出9個(gè)入血成分抗胃潰瘍的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，其中有蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ是治療胃潰瘍的有效成分，其主要是通過作用于TNF、IL-6、VEGFA、NOS3、IL-10靶點(diǎn)進(jìn)而對(duì)AGE-RAGE、PI3K-Akt等信號(hào)通絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，從而發(fā)揮抗?jié)兊淖饔?。其中，根?jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)最初是由TNF參與的，再通過減少IL-6、IL-10炎癥因子的釋放進(jìn)而控制炎癥反應(yīng)[11]，VEGFA 是VEGF生長(zhǎng)因子家族的成員，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化與遷移功能，茅蒼術(shù)通過此靶點(diǎn)加速潰瘍的愈合[12]。此外，血清中的NOS與胃黏膜的保護(hù)作用息息相關(guān)，如含量較低，則胃黏膜受損較嚴(yán)重[13]。因此，茅蒼術(shù)治療胃潰瘍可能通過調(diào)節(jié)IEC-6、TNF、IEC-10、VEGFA、NOS3來治療胃潰瘍。而主要發(fā)揮作用的有效成分是蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)素。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，篩選蒼術(shù)的有效成分和可能作用得靶點(diǎn)，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行深入分析，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)蒼術(shù)治療胃潰瘍的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)與相關(guān)通路，體現(xiàn)蒼術(shù)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)，為接下來對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。