孫晶，張娟，郭海霞，趙釗

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250101；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院腫瘤中心，山東 濟南 250012)

高脂血癥(hyperlipoidemia，HLP)是由于人體血脂代謝紊亂引起總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等血清中脂質(zhì)和脂蛋白異常升高或降低造成的一種慢性疾病[1]。長期高脂血癥容易引發(fā)動脈粥樣硬化，導(dǎo)致冠心病、冠脈綜合征、腦梗死等心腦血管疾病[2-3]。臨床上常采用他汀類、貝特類、煙酸類、依折麥布、膽酸螯合劑等傳統(tǒng)西藥進行治療[4-6]，近幾年又有1G08、LY3015014和BMS-962476等PCSK9抑制劑上市[7]，但均有一定的副作用。本研究采用藥食同源的丹參、靈芝、三七與紅茶等制成保健食品袋泡茶，探索其降血脂作用，并對其安全性進行評價。

1 材料

1.1 受試樣品 丹參靈芝三七茶，丹參、靈芝、三七、紅茶等經(jīng)粉碎、混合、灌裝制成，山東某生物科技有限公司提供，規(guī)格為3.3 g/袋，推薦服用量為每次2袋，每天2次。

1.2 試驗動物 SPF級Wistar大鼠體重(200±10)g、SPF級昆明種小鼠體重(20±2)g，均由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2012-0001，鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗菌購自美國Moltox公司，經(jīng)生物學(xué)鑒定符合試驗要求。

1.3 主要儀器與試劑 動物天平(日本島津UW2200H，上海銳析儀器設(shè)備有限公司)；電子天平(EX-E，天津市德安特傳感技術(shù)有限公司)；酶標儀(HBS-1101，南京德鐵實驗設(shè)備有限公司)；快速血脂測定儀(東芝TAB-120，南京豐運醫(yī)療儀器有限公司)；TC、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 高脂模型飼料 在維持飼料中添加20.0%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，以及適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉，制成高脂模型飼料。

2 方法

2.1 提取工藝篩選與驗證 本品為袋泡茶劑，無特殊推薦飲用方法，參考《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中受試樣品的處理方法設(shè)計正交試驗，以加水量、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以浸膏得率為考察指標，按照正交L9(34)進行提取試驗，篩選提取工藝參數(shù)。另取一定量受試樣品，按正交試驗獲得的最佳工藝條件進行工藝驗證試驗。

2.2 輔助降血脂功能試驗

2.2.1 樣品制備 將規(guī)格樣品按篩選的最佳提取工藝條件(溫度90 ℃、加10倍量水、提取2次、時間60 min)常壓提取，合并提取液，減壓濃縮，濃縮后樣品每mL相當于原樣品1.07 g，折合人體每天推薦用量為205 mg·kg-1。按相當于人體推薦量的10倍、30倍確定大鼠的低、高劑量組。另設(shè)煎煮液對照組，將規(guī)格樣品加水浸泡1 h，100 ℃煮沸提取2次，第1次加入10倍量水，提取時間2 h，第2次加入8倍量水，提取時間1.5 h，提取液合并，減壓濃縮，濃縮后樣品1 mL相當于原樣品1.14 g，人體每日推薦用量為193 mg·kg-1。按相當于人體推薦量的10倍設(shè)立煎煮液組。

2.2.2 試驗過程 于屏障系統(tǒng)下以維持飼料飼喂大鼠，觀察7 d。按體重隨機分為空白對照組(給予維持飼料)和模型對照組(給予模型飼料)。模型對照組給予模型飼料16 d后，空白對照組和模型對照組大鼠不禁食，經(jīng)眼內(nèi)眥采血。采血后盡快分離血清，測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。根據(jù)TC水平將模型對照組隨機分為模型對照組、丹參靈芝三七茶低劑量組、丹參靈芝三七茶高劑量組、煎煮液對照組，共4組。

受試樣品用去離子水配制，每天1次灌胃給予大鼠，灌胃體積均按1 mL·(100 g)-1計，空白對照組與模型對照組給予相當體積去離子水，模型對照組及劑量組繼續(xù)給予模型飼料，空白對照組繼續(xù)給予維持飼料。定期稱重并據(jù)此計算灌胃量，連續(xù)給予受試樣品42 d。在試驗前及試驗結(jié)束時不禁食采血，分離血清，測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。

2.3 安全性毒理學(xué)試驗 規(guī)格樣品常壓下溫度90 ℃、加10倍量水提取2次，時間60 min，提取液合并，減壓濃縮，濃縮后樣品1 mL相當于原樣品2.2 g，以此作為毒理試驗樣品。

2.3.1 急性經(jīng)口毒性試驗 檢疫合格小鼠20只，雌雄各半，禁食禁水16 h后，一次經(jīng)口灌胃給予受試樣品20 mL·kg-1，觀察14 d，記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況，試驗結(jié)束后解剖動物并記錄結(jié)果，根據(jù)急性毒性劑量分級標準評價受試樣品毒性強弱。

2.3.2 遺傳毒性試驗

2.3.2.1 Ames試驗 采用平板摻入法。按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)規(guī)定操作。試驗菌為鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統(tǒng)。

2.3.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 采用間隔24 h兩次經(jīng)口灌胃法進行試驗。取體重25～30 g小鼠50只，雌雄各半，分5組，受試樣品分為2.50、5.00、10.00 g·kg-1共3個劑量，40 mg·kg-1環(huán)磷酰胺為陽性對照，蒸餾水為陰性對照，末次給受試樣品6 h后，處死動物，取胸骨做骨髓涂片。每只動物觀察200個嗜多染紅細胞(PCE)，并同時計數(shù)正染紅細胞(NCE)，計算PCE/NCE比值。每只動物計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞，計算微核率。

2.3.2.3 小鼠精子畸形試驗 體重25～35 g雄性小鼠25只，分為5組。受試樣品劑量分別為2.50、5.00、10.00 g·kg-1。蒸餾水為陰性對照，40 mg·kg-1環(huán)磷酰胺為陽性對照，每天灌胃1次，連續(xù)5 d，末次給予受試樣品后第30天處死動物，取附睪涂片，每只動物計數(shù)1 000個結(jié)構(gòu)完整精子，計算畸變精子發(fā)生率。

2.3.3 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗 將SPF級大鼠80只隨機分為低、中、高劑量組和對照組，20只/組，雌雄各半。低中高劑量分別相當于人體推薦量的25倍、50倍、100倍，高劑量組以原濃縮液灌胃，低、中劑量組經(jīng)稀釋制成，對照組給予蒸餾水，灌胃體積均為10 mL·kg-1，連續(xù)30 d。每周稱一次體重，第31天禁食16 h后，稱重，戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，測定血常規(guī)和血生化指標，解剖動物并取材進行病理檢查。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取工藝篩選結(jié)果 丹參靈芝三七茶正交試驗結(jié)果表明，影響浸膏得率的因素作用主次為提取次數(shù)>提取時間>加水量>提取溫度，其中提取次數(shù)和提取時間對提取工藝影響最大，提取溫度影響最小。提取次數(shù)2次、提取時間60 min、加水量10倍、提取溫度90 ℃為最佳提取工藝條件。正交試驗選擇及結(jié)果見表1和表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

3.2 工藝驗證試驗結(jié)果 取一定量樣品，按D2C2A1B3提取工藝條件進行3次提取工藝驗證試驗，浸膏得率平均值為20.92%，RSD為0.823%，表明正交試驗篩選出的提取工藝穩(wěn)定，驗證結(jié)果見表3。

表3 工藝驗證試驗結(jié)果

3.3 輔助降血脂功能試驗

3.3.1 丹參靈芝三七茶對大鼠體重的影響 各組大鼠生長良好，體重均表現(xiàn)逐漸增長趨勢?？瞻讓φ战M、受試樣品低、高劑量組和煎煮液對照組的動物體重與模型對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明丹參靈芝三七茶對大鼠體重無顯著影響，結(jié)果見表4。

表4 丹參靈芝三七茶對大鼠體重的影響

3.3.2 丹參靈芝三七茶對大鼠血脂的影響 空白對照組血清TG、TC和LDL-C含量均顯著低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明高脂血癥動物模型成立。在給予受試樣品試驗前，與模型對照組比較，各劑量組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表5。

表5 試驗前各組大鼠血清TC、HDL-C、TG、LDL-C含量比較

給予受試樣品試驗后，與模型對照組比較，樣品高劑量組及煎煮液對照組大鼠血清TC、LDL-C和TG含量均顯著下降(P<0.05)。各劑量組血清HDL-C含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但有升高趨勢?？瞻讓φ战M血清TG、TC和LDL-C含量均顯著低于模型對照組(P<0.01)。表明不同提取方式制備的受試樣品輔助降血脂功能動物試驗結(jié)果陽性，結(jié)果見表6。

表6 試驗后各組大鼠血清TC、HDL-C、TG、LDL-C含量比較

注：與模型對照組比較，**P<0.01

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.4 安全性毒理學(xué)試驗

3.4.1 急性經(jīng)口毒性試驗 以動物最大灌胃體積20 mL·kg-1，一次性灌胃給予受試樣品濃縮液后，各試驗動物未見明顯活動異常及中毒癥狀，14 d內(nèi)動物無死亡。該劑量相當于原樣品44 g·kg-1，是人體推薦日用量0.22 g·kg-1的200倍。依據(jù)急性毒性分級標準，丹參靈芝三七茶屬無毒級。

3.4.2 遺傳毒性試驗 Ames試驗結(jié)果顯示，對TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗菌株，加與不加S-9，樣品各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)2倍，且無劑量-效應(yīng)關(guān)系。

小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果顯示，受試樣品各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著差異(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組與陰性對照組比較差異顯著(P<0.01)，受試樣品各劑量組的PCE/NCE比值均不低于陰性對照組的20%，因此，樣品對小鼠骨髓細胞未見明顯毒性。

小鼠精子畸形試驗結(jié)果顯示，受試樣品各劑量組小鼠精子畸形發(fā)生率與陰性對照組比較無顯著差異(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組與陰性對照組比較有顯著差異(P<0.01)。

3.4.3 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗 試驗期間動物活動、攝食和排便等一般狀況未見明顯差異；與對照組比較，各劑量組雌、雄大鼠攝食量、體重增重和食物利用率無明顯差異，主要臟器的重量及臟體比無明顯差異，血常規(guī)指標、血生化指標無明顯差異；解剖觀察各劑量組動物，未見明顯臟器的肉眼病變和病理組織學(xué)改變。

4 討論與結(jié)論

丹參靈芝三七茶是采用藥食同源原料丹參、靈芝、三七與紅茶按照中醫(yī)古方制成的袋泡茶，以期尋求通過簡單的沖泡方式實現(xiàn)輔助降低血脂功效的保健功能食品。丹參又名赤參、紫丹參、活血根等，常用于治療冠心病、心絞痛、腦梗死、高血脂等癥。丹參中含有的主要水溶性成分為丹酚酸B、丹酚酸A、丹參素、原兒茶醛等酚酸類成分[8]，研究顯示丹參水提取物灌服大鼠后，血清中出現(xiàn)丹參素鈉吸收峰，表明丹參素可經(jīng)胃腸道吸收[9]，其吸收入血后能通過抑制內(nèi)源性膽固醇合成和明顯增加肝細胞膽固醇7α-羥化酶(CYP7A) mRNA表達，促進膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而降低血漿中膽固醇含量。另外，丹參素可降低血漿總同型半胱氨酸水平，維持氧化還原平衡，降低高脂血癥的發(fā)病風(fēng)險[10-11]。三七可以使血清中三酰甘油和總膽固醇水平顯著降低，減少主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊的同時減輕動脈壁受損情況[12]，可明顯改善TC、TG、LDL-C和HDL-C[13]。近代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝能降低患心血管疾病的風(fēng)險，預(yù)防多種疾病模型的心臟損害，具有改善冠狀動脈血液循環(huán)、降低心肌耗氧量和耗糖量、增強心肌對機體缺氧的耐受力等作用[14-15]。靈芝能明顯降低血清TC、TG、LDL-C及升高HDL-C，還可降壓、軟化血管、降低血液黏度等抗動脈硬化的作用[16-17]。紅茶為六大茶類之一，為全發(fā)酵茶，含有茶多酚、茶黃素、黃酮等成分，這些成分都具有調(diào)節(jié)血脂的功效[18]。本文參照國食藥監(jiān)保化〔2012〕107號《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》附件6“輔助降低血脂功能評價方法”，用高脂飼料建立大鼠混合型高脂血癥動物模型，研究丹參靈芝三七茶對大鼠血脂水平的影響。結(jié)果顯示，樣品高劑量組及煎煮液能顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG和LDL-C含量，同時對血清HDL-C含量有升高趨勢。表明丹參靈芝三七茶沖泡服用和煎煮服用均具有降血脂作用。采用急性經(jīng)口毒性試驗、Ames 試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗和30 d喂養(yǎng)試驗對丹參靈芝三七茶進行安全性毒理學(xué)評價，結(jié)果顯示該受試樣品屬無毒級，遺傳毒性試驗結(jié)果為陰性，30 d喂養(yǎng)試驗未發(fā)現(xiàn)有意義的病理性損傷。根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評價程序》 GB 15193.1-2014，丹參靈芝三七茶未見明顯毒性作用，表明該產(chǎn)品安全無毒副作用。