邵菊芳 龔春生 方婷婷 王翔宇 陳澤坤 朱紅威

(中國礦業(yè)大學 化工學院，徐州 221116)

引 言

細菌生物膜是由細菌菌群分泌的黏液所形成的保護膜，可以避免或減少菌體受到外界環(huán)境的侵害。相對單個、分散、游離細菌的生存狀態(tài)，生物膜是細菌適應外界環(huán)境的一種特殊生存形式。細菌生物膜是導致食源性疾病的主要誘因，可以造成食物變質，引發(fā)公共衛(wèi)生問題[1-2]，因此在食品安全領域備受矚目[3]。根據美國全國衛(wèi)生研究所(NIH)預計，當食品污染事件發(fā)生時，問題的來源往往就是生物膜[4]。1996年因大腸桿菌(Escherichiacoli)O157污染導致的日本多所小學集體食物中毒事件，是人們熟知的重大公共衛(wèi)生事件之一。因此，消除或抑制細菌生物膜對于保障人們的身體健康具有重要意義。

細菌生物膜可以使致病菌的耐藥性提高，還能躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[5-6]，具有頑固難清除的特點[7]。目前常用的消毒劑和抗菌劑對致病菌生物膜的清除效果并不明顯，且這些消毒劑多為化學物質，對環(huán)境不友好。因此，尋找安全有效的消毒劑是食品安全領域亟待解決的問題之一。

近年來，天然植物成分對生物膜的抑制成為研究熱點之一。天然植物中活性成分的種類繁多，且具有無毒、安全、環(huán)境友好等特點，成為篩選抑制細菌生物膜的優(yōu)勢資源庫[8-13]。藥用植物銀杏(Ginkgobiloba)是我國傳統(tǒng)且特有的樹種，其中多種活性成分具有抑菌、抗感染的效果，作用靶點多，在治療細菌感染方面獨具優(yōu)勢。吳海霞[14]研究證明，銀杏種仁酚酸對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有較強的抑制作用，銀杏種仁多糖對枯草芽孢桿菌有較強的抑制作用，銀杏種仁蛋白對革蘭氏陰性和陽性細菌均有抑制作用。黃小炯等[15]研究發(fā)現(xiàn)銀杏果中的抗菌蛋白對大腸桿菌有較強的抑菌效果。趙琪珂[16]研究表明銀杏葉多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、八疊球菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制效果最好。邵菊芳[17]研究發(fā)現(xiàn)，當2.25 mg/mL銀杏細胞黃酮與大腸桿菌作用10 h時，對大腸桿菌的抑制率高達81%。以上研究主要集中在銀杏各成分對細菌菌體的抑制方面，而對細菌生物膜影響的研究甚少。因此，為了開發(fā)潛在的植物源殺菌消毒劑，本文以乙醇為提取溶劑從銀杏葉中提取總黃酮，考察了銀杏葉黃酮對大腸桿菌生物膜形成和黏附性的影響，以期為解決食品領域的細菌生物膜污染問題提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1實驗材料

銀杏葉采自中國礦業(yè)大學南湖校區(qū)校園內銀杏樹，品種為佛手；大腸桿菌BL21菌株、LB無菌液體培養(yǎng)基、U型96孔板，生工生物工程(上海)股份有限公司；蘆丁標準品、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、結晶紫、冰乙酸、甲醇、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑、酚酞、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；DA201大孔樹脂，天津波鴻樹脂科技有限公司。

1.1.2實驗儀器

DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；UV1780型紫外可見分光光度計，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；EL-204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SCIENTZ-Ⅱ型超聲波粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；PYX-DHS-350型恒溫培養(yǎng)箱、HYL-B型恒溫搖床，太倉市璜涇鎮(zhèn)強樂實驗設備廠；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；2-16P型高速離心機，德國Sigma公司。

1.2 總黃酮標準曲線繪制[18]

配制質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準液100 mL，分別取蘆丁標準液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL刻度試管中，用30%(體積分數(shù))乙醇補至12.5 mL，加入0.7 mL NaNO2溶液(0.05 g/mL)，搖勻，放置5 min后加入0.7 mL Al(NO3)3溶液(0.1 g/mL)，放置5 min后加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，混勻，靜置10 min。使用紫外可見分光光度計于510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3 總黃酮的提取純化

采摘新鮮銀杏葉500 g，于65 ℃烘干至恒重，研磨成粉末，過60目篩(篩孔尺寸為0.25 mm)備用[19]。稱取銀杏葉粉末10 g，以150 mL 75%(體積分數(shù))乙醇為提取溶劑，超聲波破碎處理，于30 ℃振蕩2 s、間歇1 s，處理20 min。置于65 ℃的恒溫水浴中1 h，過濾，將濾渣重新加入150 mL 75%乙醇中，加熱3 h，過濾，棄濾渣，合并濾液[20]。利用1.2節(jié)繪制的標準曲線計算總黃酮的提取率，計算公式如下。

式中，E為總黃酮的提取率，%；m0為提取液中黃酮的質量，g；m為銀杏葉粉末的質量，g。

使用DA201大孔樹脂將黃酮初提液純化[21]，使用旋轉蒸發(fā)儀將純化后的黃酮提取液減壓濃縮，真空干燥，制得干粉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生物膜的培養(yǎng)[22]

將活化的大腸桿菌BL21接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃以200 r/min在恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，取對數(shù)生長期的細菌稀釋100倍，以每孔0.1 mL加入到U型96孔板中。每孔菌液中加入0.1 mL LB培養(yǎng)基，混勻，以每孔0.2 mL的LB培養(yǎng)基為對照，在恒溫培養(yǎng)箱中于37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.5 生物膜生長曲線測定

吸去菌液，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)洗板3次，吸去洗液后晾干。加入甲醇固定20 min，吸去液體后晾干。將 0.05 mL結晶紫染色液(0.01 g/mL)加入孔板，輕搖使染色均勻。靜置5 min，用去離子水沖洗孔板，晾干。吸取0.2 mL 33%(體積分數(shù)，下同)冰乙酸加入孔板，待生物膜完全溶解，加入到25 mL刻度試管中，用33%冰乙酸補至5 mL。使用紫外可見分光光度計在600 nm處測量不同培養(yǎng)時間的溶液的吸光度，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生物膜生長曲線。

1.6 大腸桿菌抑菌率測定[23]

將黃酮干粉配制成質量濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL的7個梯度，以水為空白對照。取各濃度的黃酮溶液稀釋1倍，以每孔0.1 mL加入到U型96孔板中，每個濃度做3個平行，共接種24孔。將活化培養(yǎng)24 h的大腸桿菌菌液稀釋10萬倍，各孔黃酮稀釋液中接種0.1 mL菌液，于37 ℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，每組涂布3個平板。于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，對菌落進行計數(shù)。沒有大腸桿菌生長的平板上對應的銀杏葉黃酮濃度為最小抑菌濃度(MIC)，按照下式計算對大腸桿菌的抑菌率。

式中，Ri為抑菌率，%；n0為空白對照的菌落數(shù)；n為實驗組的菌落數(shù)。

1.7 銀杏葉黃酮對生物膜的影響

1.7.1生物膜的分離

按照1.4節(jié)的方法接種大腸桿菌，將質量濃度為0(空白對照)、0.5、1、2倍MIC的黃酮溶液稀釋1倍后取1 mL加入到菌液中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。稱量各離心管的質量后，參照1.5節(jié)的方法溶解生物膜后，將各孔板中的菌液分別移入離心管，于7 800 r/min離心5 min，棄上清液，測定離心管加沉淀物的質量，按照下式計算生物膜質量。

Gf=G-Gt

式中，Gf為生物膜質量，mg；G為離心管加沉淀物的質量，mg；Gt為離心管的質量，mg。

1.7.2生物膜形成抑制率及黏附性抑制率測定

按1.4節(jié)的培養(yǎng)方法，經0(空白對照)、0.25、0.5、1倍MIC的銀杏葉黃酮處理的大腸桿菌生物膜，于37 ℃培養(yǎng)24 h。按1.7.1節(jié)的方法分離生物膜，測定生物膜質量，按照下式計算生物膜形成抑制率。

式中，Rf為生物膜形成抑制率，%；G0為空白對照的生物膜質量，mg；G1為銀杏葉黃酮抑制后的生物膜質量，mg。

按照1.5節(jié)的方法將生物膜進行染色洗板，用33%冰乙酸溶解生物膜，并補至3 mL。使用紫外可見分光光度計在600 nm處測量各樣品染色液的吸光度，按照下式計算生物膜黏附性抑制率。

式中，Ra為黏附性抑制率，%；A0為空白對照的吸光度；A為實驗組的吸光度。

1.7.3葡萄糖標準曲線繪制[24]

配制10 mg/mL葡萄糖標準液，分別取1.6、3.2、4.8、6.4、8、9.6 mL加入到25 mL刻度試管，加去離子水補至20 mL，加入1.5 mL DNS試劑后搖勻，沸水浴加熱5 min。加去離子水補至25 mL，混勻。以未加入葡萄糖標準液的樣液為空白，使用紫外可見分光光度計在540 nm處測定各管溶液的吸光度。以葡萄糖的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.7.4胞外多糖的水解、提取及生物膜多糖含量的測定[25]

于裝有生物膜的離心管中加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸及0.15 mL去離子水，吸出樣液加入到25 mL刻度試管中，在水浴鍋中于100 ℃水解30 min。在此過程中防止蒸干，適當加入幾滴蒸餾水，水解后測量其體積。待水解液冷卻后，加入1滴酚酞指示劑，加入6 mol/L NaOH溶液中和變色，得到待測液，測量其體積。取0.4 mL待測液，加入0.3 mL DNS試劑，在沸水浴中加熱5 min，取出后加入去離子水補至5 mL，混勻，得到測定液。以不加生物膜的離心管為空白，使用紫外可見分光光度計在540 nm處測定吸光度，利用葡萄糖標準曲線，按照下式計算胞外多糖含量。

式中，C為胞外多糖含量，%；A0為空白對照的吸光度；V為待測液體積，mL；M為生物膜質量，mg。

2 結果與討論

2.1 黃酮標準曲線及黃酮含量測定結果

圖1為蘆丁的標準曲線。蘆丁的質量濃度ρ與吸光度A的關系式為：ρ=6.192A-0.000 8，決定系數(shù)R2=0.999，表明在0.008～0.048 mg/mL的范圍內，蘆丁的質量濃度與吸光度的線性關系良好。參照此標準曲線方程，可得乙醇提取后提取液中黃酮的質量濃度為0.15 mg/mL，計算得到提取率為1.71%。經DA201大孔樹脂純化后，純化液中黃酮的質量濃度為1 mg/mL，減壓濃縮后黃酮的質量濃度可達4.635 mg/mL，表明黃酮類化合物經純化、濃縮，含量得到了顯著的提高。

圖1 蘆丁的標準曲線

2.2 生物膜生長曲線

圖2為大腸桿菌生物膜的生長曲線。生物膜的形成過程分為4個時期：黏附初期、黏附期、成熟期和脫落期[12]。由圖2可知，大腸桿菌菌株在37 ℃培養(yǎng)2 h時完成初黏附，4 h形成成熟的生物膜，4～8 h生物膜脫落，8 h之后生物膜開始新的生長周期。在接下來的周期中，由于代謝產物的積累和營養(yǎng)物質的消耗，生物膜的生長變慢，周期變長。根據生長曲線，培養(yǎng)時間為12 h時生物膜最強壯，胞外基質最豐富，黏附性最強。

圖2 大腸桿菌生物膜的生長曲線

2.3 銀杏葉黃酮對大腸桿菌抑菌率的影響

圖3為不同質量濃度的銀杏葉黃酮對大腸桿菌抑制率的影響。由圖3可知，4 mg/mL和8 mg/mL的銀杏葉黃酮對大腸桿菌的生長有顯著的抑制作用，抑菌率分別為99.59%和99.25%；0.25～2 mg/mL銀杏葉黃酮的抑菌率為82.63%～89.42%；0.125 mg/mL銀杏葉黃酮的抑菌率與空白對照組無明顯差別，抑菌率約為16%。由此得出銀杏葉黃酮對大腸桿菌的MIC為4 mg/mL。相對于肉桂(MIC為3.125 mg/mL)、丁香(MIC為6.25 mg/mL)等抑制作用廣泛、用量低的植物殺菌劑[26]，銀杏葉黃酮對大腸桿菌的抑菌活性為中等水平。

n=3，結果以“平均值±標準差”表示，下同。

2.4 銀杏葉黃酮對生物膜形成量及黏附性的影響

圖4為銀杏葉黃酮對大腸桿菌生物膜形成量及黏附性的影響。由圖4可知，當銀杏葉黃酮的質量濃度為0.25倍和0.5倍MIC時，生物膜形成抑制率分別為22.72%和15.91%；質量濃度為1倍MIC時生物膜形成抑制率為59.09%，相比0.25倍和0.5倍MIC組分別提高了36.37%和43.18%。結果表明，銀杏葉黃酮的質量濃度為1倍MIC時，對生物膜形成的抑制效果顯著。

圖4 銀杏葉黃酮對大腸桿菌生物膜形成量及黏附性的影響

當銀杏葉黃酮的質量濃度為0.25倍和0.5倍MIC時，黏附性抑制率分別為14.63%和10.02%；質量濃度為1倍MIC時黏附性抑制率為28.99%，相比0.25倍和0.5倍MIC組分別提高了14.36%和18.97%。結果表明，銀杏葉黃酮的質量濃度為1倍MIC時，對生物膜黏附的抑制效果顯著。

2.5 葡萄糖標準曲線及銀杏葉黃酮對胞外多糖含量的影響

圖5為葡萄糖的標準曲線。由圖5可得葡萄糖的質量濃度ρ與吸光度A的關系式為：ρ=0.21A-0.025 2，R2=0.998 1，表明在0.8～4.8 mg/mL的范圍內，葡萄糖的質量濃度與吸光度的線性關系良好。

圖5 葡萄糖的標準曲線

圖6為銀杏葉黃酮對大腸桿菌生物膜胞外多糖含量的影響。由圖6可知，銀杏葉黃酮的質量濃度為1倍和2倍MIC時對生物膜多糖的抑制效果較為明顯，在培養(yǎng)24 h時，胞外多糖含量相比對照組(0 MIC)分別減少了1.83%和2.12%。銀杏葉黃酮的質量濃度為0.25倍和0.5倍MIC時，對生物膜多糖合成的抑制效果微弱，在培養(yǎng)48 h時胞外多糖含量分別比對照組減少0.18%和0.6%。結果表明，當銀杏葉黃酮的質量濃度在1倍MIC以上時對大腸桿菌生物膜多糖的形成有明顯的抑制作用?？梢酝茰y，銀杏葉黃酮通過抑制胞外聚合物中多糖的分泌，抑制大腸桿菌生物膜的形成及黏附。

圖6 不同質量濃度的銀杏葉黃酮對大腸桿菌生物膜胞外多糖含量的影響

3 結論

銀杏葉黃酮可抑制大腸桿菌菌體的生長，MIC為4 mg/mL；對大腸桿菌生物膜的形成和黏附有抑制作用，銀杏葉黃酮的質量濃度為1倍MIC時，生物膜形成抑制率為59.09%，黏附性抑制率為28.99%；銀杏葉黃酮的質量濃度在1倍MIC以上時，對大腸桿菌生物膜多糖的形成有明顯的抑制作用。