張 涵 李宇辰 聶晶磊 任 杰 曾安平,3*

(1.北京化工大學(xué) 軟物質(zhì)科學(xué)與工程高精尖創(chuàng)新中心，北京 100029；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100081；3.漢堡工業(yè)大學(xué)，德國(guó)漢堡 21073)

引 言

為了順應(yīng)全球綠色低碳發(fā)展的趨勢(shì)[1]，我國(guó)于2020年明確設(shè)定了“碳達(dá)峰”和“碳中和”的目標(biāo)，并將其納入生態(tài)文明建設(shè)的整體布局之中。實(shí)現(xiàn)碳中和的主要方式是碳抵消和發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)[2]，而CO2資源化利用(C1合成)是發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)的重要一環(huán)，其主要通過(guò)羧基化或還原途徑將CO2轉(zhuǎn)化成化學(xué)制品或燃料[3-4]，因此，C1合成的研究對(duì)于CO2的高效資源化利用具有重要意義。目前，已有多條C1合成途徑被提出，例如絲氨酸途徑[5]、還原甘氨酸途徑[6]、還原乙酰輔酶A途徑[7]以及核酮糖-磷酸途徑[8]等，其中還原甘氨酸途徑由于遠(yuǎn)離中心代謝途徑以及具有合理的高化學(xué)動(dòng)力而被認(rèn)為是最有前景的C1合成途徑[9]。還原甘氨酸途徑以CO2還原產(chǎn)生的C1化合物——甲酸作為原料，首先，甲酸與輔因子四氫葉酸(THF)相連實(shí)現(xiàn)活化，之后被還原生成亞甲基-四氫葉酸(methylene-THF)；進(jìn)一步地，methylene-THF作為C1供體與CO2和NH3聯(lián)合反應(yīng)，并在甘氨酸裂解酶系的催化下生成C2化合物——甘氨酸；此后，甘氨酸繼續(xù)與methylene-THF結(jié)合，生成C3化合物——絲氨酸；最終，絲氨酸會(huì)被轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)入中心代謝網(wǎng)絡(luò)以合成下游化學(xué)品[10-13]。

甘氨酸裂解酶系主導(dǎo)的甘氨酸合成反應(yīng)是還原甘氨酸途徑固碳的關(guān)鍵步驟[14]，該酶系在上世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)并在隨后的30年中被深入研究[15-18]。甘氨酸裂解酶系主要包含4種蛋白，分別為H-蛋白、P-蛋白、T-蛋白和L-蛋白。其中，H-蛋白是一種穿梭蛋白[19]，它在共價(jià)連接硫辛酸配體后會(huì)分別連接其他3種催化蛋白的催化反應(yīng)中心以進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。H-蛋白穿梭在其他三種催化蛋白的活性中心的過(guò)程中會(huì)與其共價(jià)配體形成三種形態(tài)，即氧化態(tài)(Hox)、過(guò)渡態(tài)(Hint)和還原態(tài)(Hred)。在氧化態(tài)和還原態(tài)下，H蛋白的共價(jià)配體(硫辛酸或二氫硫辛酸)可在水溶液中自由移動(dòng)[20]。而在過(guò)渡態(tài)下，H-蛋白的共價(jià)配體(硫辛酰胺)在水溶液中容易發(fā)生水解(氨甲基易被水解生成甲醛)，因此在過(guò)渡態(tài)下，H-蛋白會(huì)采取一種自保護(hù)機(jī)制將硫辛酰胺配體環(huán)抱在自身空腔內(nèi)部保護(hù)起來(lái)[19]。在H-蛋白與T-蛋白反應(yīng)時(shí)，T-蛋白會(huì)先與H-蛋白接觸以解開(kāi)H-蛋白的自保護(hù)機(jī)制，此時(shí)硫辛酰胺配體被釋放至T-蛋白內(nèi)，從而進(jìn)行下一步催化反應(yīng)[21]。

值得注意的是，還原甘氨酸途徑中核心產(chǎn)物甘氨酸的合成反應(yīng)是可逆的，在甘氨酸裂解酶系的主導(dǎo)下，催化反應(yīng)更趨向于甘氨酸的裂解而非合成[14]。一些研究者試圖闡釋甘氨酸裂解酶系的催化機(jī)制，例如，Gueguen等[22]在1999年提出，H-蛋白中Glu-14對(duì)硫辛酰胺臂(硫辛酰胺與H-蛋白Lys-64側(cè)鏈共價(jià)形成的分子擺臂)在疏水空腔中的穩(wěn)定存在發(fā)揮著重要作用，將Glu-14突變?yōu)楸彼岷?，疏水空腔被破壞，此時(shí)硫辛酰胺臂無(wú)法在疏水空腔中穩(wěn)定存在，從而導(dǎo)致甘氨酸裂解酶系的催化效率大大降低。Okamura-Ikeda等[23]在2010年首次結(jié)晶出H-T蛋白復(fù)合物，并發(fā)現(xiàn)T-蛋白中的Arg-292對(duì)H-T蛋白復(fù)合物的自組裝發(fā)揮關(guān)鍵作用；將Arg-292突變?yōu)楸彼岷?，H-蛋白和T-蛋白雖然能夠正常表達(dá)，但不能正常組裝，從而導(dǎo)致甘氨酸的合成/裂解反應(yīng)幾乎不能進(jìn)行。然而到目前為止，甘氨酸裂解酶系的蛋白相互作用機(jī)制仍不清楚，且難以實(shí)現(xiàn)甘氨酸裂解酶系催化效率的調(diào)控，后者將有助于我們進(jìn)一步在分子層面上理解甘氨酸裂解/合成反應(yīng)，并對(duì)于通過(guò)蛋白質(zhì)工程提高C1合成效率具有重要的指導(dǎo)意義。

本課題組在前期工作中，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬手段對(duì)T-蛋白解開(kāi)H-蛋白自保護(hù)的行為進(jìn)行了研究[24]。通過(guò)分析T-蛋白誘導(dǎo)H-蛋白解開(kāi)自保護(hù)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)軌跡，我們鎖定了硫辛酰胺離開(kāi)空腔過(guò)程中的3個(gè)潛在的關(guān)鍵氨基酸殘基：Ser-67、Asp-68和Tyr-70。由于Ser-67主導(dǎo)的這一階段在硫辛酰胺釋放的分子動(dòng)力學(xué)軌跡中占據(jù)的時(shí)間最長(zhǎng)，并且通過(guò)能量分析發(fā)現(xiàn)這一階段的能壘跨度最大，因此我們對(duì)Ser-67進(jìn)行了突變研究，發(fā)現(xiàn)Ser-67位點(diǎn)對(duì)甘氨酸裂解酶系的整體酶活有重要影響。然而，另外兩個(gè)氨基酸殘基Asp-68和Tyr-70位點(diǎn)如何影響甘氨酸裂解酶系的整體酶活目前仍不清楚。因此，本文進(jìn)一步對(duì)Asp-68和Tyr-70進(jìn)行突變，探究Asp-68和Tyr-70位點(diǎn)對(duì)甘氨酸裂解酶系整體酶活的影響，并嘗試從分子層面上闡釋酶活的變化機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)來(lái)源的H-蛋白野生型、P-蛋白、T-蛋白和L-蛋白基因的美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)序列號(hào)分別為NP_417380.1、P33195.3、P27248.3和P0A9P0.2，這4種基因的表達(dá)載體均為pET-28a，構(gòu)建出的重組質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室保存使用；E.coliBL21(DE3)及E.coliTOP10感受態(tài)購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相關(guān)試劑、瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基相關(guān)試劑、氯化鈉、Tris-HCl和咪唑購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；卡那霉素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、硫辛酸購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(T100-186109型，BIO-RAD公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ.SG41.280型，寧波久興公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(LW1908型，Longyue公司)；多功能組合式搖床(HYG-C3型，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(CR22G型，日本日立公司)；超聲細(xì)胞破碎儀(JY92-II型，寧波新芝公司)；KTA蛋白層析系統(tǒng)(美國(guó)GE Healthcare公司)；鎳柱(Ni-NTA Fast Flow column，5 mL，美國(guó)GE Healthcare公司)；凝膠成像儀(C30型，Azure Biosystems公司)；酶標(biāo)儀(Enspire型，PerkinElmer公司)；SDS-PAGE電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra System型，BIO-RAD公司)；超凈工作臺(tái)(CHSD1500型，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(V126716型，Eppendorf公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀(Mini-Sub Cell GT型，BIO-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建

H-蛋白Asp-68位突變體質(zhì)粒和Tyr-70位突變體質(zhì)粒的構(gòu)建參照定點(diǎn)突變?cè)噭┖刑峁┑姆椒ㄟM(jìn)行，具體涉及的引物如表1所示。引物的DNA熔解溫度(Tm)均為(60±1)℃。PCR反應(yīng)體系為：1 μL Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase、25 μL 2×Max Buffer、1 μL dNTP、2 μL上游引物、2 μL下游引物、1 μL模板質(zhì)粒、18 μL超純水。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸4 min，循環(huán)29次，72 ℃終延伸10 min，12 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，使用瓊脂糖凝膠電泳(120 V, 30 min, 常溫常壓)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，所用瓊脂糖的質(zhì)量濃度為10 g/L。然后使用Dpn1消解PCR產(chǎn)物中的模板質(zhì)粒(37 ℃，1 h)。使用該Dpn1消解產(chǎn)物進(jìn)行同源重組(37 ℃，30 min)，完成質(zhì)粒環(huán)化過(guò)程。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10感受態(tài)中，經(jīng)復(fù)蘇后涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，將平板菌落送至蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將鑒定成功的質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.2.2蛋白表達(dá)與純化

通過(guò)化學(xué)熱激法將H-蛋白野生型質(zhì)粒和各突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)復(fù)蘇后將菌體涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)12 h。隨后挑取平板菌落中的單克隆菌體至4 mL的LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，在37 ℃、220 r/min下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4 h后，取1 mL菌液接種至100 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min下培養(yǎng)，待菌液在600 nm處的吸光度達(dá)到0.7左右時(shí)(約3 h)，添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG溶液。同時(shí)，向培養(yǎng)基中加入150 μmol/L硫辛酸對(duì)表達(dá)的ecHapo蛋白進(jìn)行酯化，使其形成硫辛酸臂，然后于30 ℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，通過(guò)離心(7 459×g)收集菌體。此外，還對(duì)P-蛋白、T-蛋白和L-蛋白進(jìn)行了異源表達(dá)，誘導(dǎo)過(guò)程中無(wú)需加入硫辛酸，其他操作方法與H-蛋白一致。

蛋白純化均通過(guò)鎳柱親和層析法進(jìn)行。使用50 mmol/L的Tris·HCl(pH=7.5)溶液重懸菌體。

將重懸后的菌體進(jìn)行超聲破碎處理10 min(每運(yùn)行5 s停3 s)，然后將破碎液進(jìn)行低溫冷凍離心30 min(4 ℃，7 459×g)，得到的蛋白上清液用于下一步蛋白純化，后續(xù)操作均在KTA蛋白層析系統(tǒng)上進(jìn)行。將含有蛋白的上清液進(jìn)行過(guò)膜處理(膜孔徑0.2 μm)，使用Buffer A(500 mmol/L氯化鈉、50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L咪唑，pH7.4)將蛋白樣品上樣至鎳柱中，然后使用5%的Buffer B(500 mmol/L氯化鈉、50 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L咪唑，pH7.4)洗脫雜蛋白，洗脫體積為10倍柱體積。最后采用線(xiàn)性洗脫方式(6%～100% Buffer B)洗脫目標(biāo)蛋白，洗脫體積為20倍柱體積。使用50 mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=7.5)將純化后的目標(biāo)蛋白稀釋至咪唑濃度低于1 mmol/L。使用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)純化蛋白進(jìn)行分析(150 V, 60 min，常溫常壓)，所用聚丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為100 g/L。使用凝膠成像儀觀(guān)察條帶位置并拍照。

1.2.3酶活測(cè)定

通過(guò)測(cè)定還原型輔酶Ⅰ(NADH)在340 nm下的吸光度變化來(lái)表征甘氨酸裂解酶系整體裂解方向的催化活性。酶活測(cè)定體系為：200 μL體系、1 mmol/L甘氨酸、1 mmol/L NAD+、1 mmol/L四氫葉酸、0.1 mmol/L磷酸吡哆醛、6 μmol/L P-蛋白、13 μmol/L T-蛋白、8 μmol/L L-蛋白、100 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)以及6 μmol/L H-蛋白野生型或突變型，甘氨酸作為整體反應(yīng)的啟動(dòng)項(xiàng)最后加入。加入甘氨酸后立即將體系置于酶標(biāo)儀中測(cè)定NADH的吸光度，每間隔5 s測(cè)定一次。整體反應(yīng)溫度設(shè)定為37 ℃，以反應(yīng)5 min內(nèi)初始階段的線(xiàn)性反應(yīng)速率計(jì)算酶活。酶活的定義為：每分鐘生成1 μmoL NADH所用H-蛋白的量為一個(gè)酶活單位(U)。酶活測(cè)定均平行進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)由R version 3.5.3運(yùn)行獲得。通過(guò)方差分析(F檢驗(yàn))計(jì)算樣本中兩組數(shù)據(jù)之間的P值，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和可視化

H-蛋白68位突變體模型(H-D68R，H-D68G)和70位突變體模型(H-Y70R，H-Y70L)均由Alphafold2構(gòu)建(源代碼：https://github.com/deepmind/alphafold)[25]。每個(gè)突變體建模完成之后會(huì)產(chǎn)生ranked_{0,1,2,3,4}.pdb共5個(gè)模型結(jié)構(gòu)，且這5個(gè)模型結(jié)構(gòu)均已經(jīng)過(guò)能量?jī)?yōu)化并按照模型置信度的大小排列。其中ranked_0.pdb的置信度最高，本研究均選用ranked_0.pdb作為最終建模結(jié)果，以便從分子層面上對(duì)酶活結(jié)果進(jìn)行分析和闡釋。本文中蛋白空腔體積均由在線(xiàn)服務(wù)器3Vee(http://3vee.molmovdb.org/)計(jì)算得出，所有蛋白質(zhì)的可視化均由PyMOL軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 H- 蛋白Asp- 68和Tyr- 70位帶正電突變結(jié)果

在H-蛋白Ser-67位點(diǎn)的研究中，我們將空腔內(nèi)關(guān)鍵氨基酸Ser-67突變?yōu)閭?cè)鏈帶正電的氨基酸后，甘氨酸裂解酶系的整體酶活相對(duì)野生型均有一定下降[24]。本研究將Asp-68和Tyr-70位點(diǎn)分別突變?yōu)榫彼?Arg)、賴(lài)氨酸(Lys)和組氨酸(His)，其中，Asp-68對(duì)應(yīng)的突變體分別記為H-D68R、H-D68K和H-D68H，Tyr-70對(duì)應(yīng)的突變體分別記為H-Y70R、H-Y70K和H-Y70H，考察突變體相對(duì)野生型的甘氨酸裂解酶系的整體酶活變化。

2.1.1蛋白表達(dá)和純化結(jié)果

圖1(a)和1(b)分別為68位帶正電殘基突變體和70位帶正電殘基突變體的SDS-PAGE結(jié)果。通過(guò)異源表達(dá)及蛋白純化，野生型H-蛋白(H-wt)、Asp-68位帶正電殘基突變體和Tyr-70位帶正電殘基突變體在SDS-PAGE上均呈現(xiàn)均一條帶，表明成功得到H-蛋白及其突變體的純化蛋白，其純度滿(mǎn)足酶活測(cè)定的要求。但是，H-蛋白突變體和野生型H-蛋白的表觀(guān)分子量(約25 kDa)和理論分子量(約14 kDa)并不一致，這可能是由于H-蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，在電泳之前的沸水滅活處理并不能使蛋白的三維結(jié)構(gòu)被完全破壞，導(dǎo)致H-蛋白在電泳圖中的條帶位置并不完全由理論分子量決定，從而呈現(xiàn)出條帶位置的差異[26]。此外，我們還對(duì)甘氨酸裂解酶系中的P-蛋白(約104 kDa)、T-蛋白(約41 kDa)和L-蛋白(約51 kDa)進(jìn)行了異源表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)，其凝膠電泳結(jié)果如圖1(c)所示，結(jié)果表明成功得到純化蛋白，其純度滿(mǎn)足酶活測(cè)定要求，得到的純化蛋白用于后續(xù)甘氨酸裂解酶系的整體酶活測(cè)定。

圖1 野生型H-蛋白、H蛋白68位帶正電殘基突變體、H蛋白70位帶正電殘基突變體、P-蛋白、T-蛋白及L-蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

2.1.2甘氨酸裂解酶系酶活測(cè)定結(jié)果

分別測(cè)定野生型H-蛋白以及Asp-68和Tyr-70帶正電殘基突變體的酶活，結(jié)果如圖2所示。圖2(a)中，Asp-68突變體的甘氨酸裂解酶系整體酶活相對(duì)野生型均有不同程度的降低，H-D68K、H-D68H和H-D68R的酶活分別降低了44.6%、48.9%和90.2%，表明H-蛋白的Asp-68位點(diǎn)對(duì)于甘氨酸裂解酶系的整體酶活具有重要影響。上述Asp-68位帶正電殘基突變體的酶活均降低，這與Ser-67位帶正電殘基突變體的酶活變化趨勢(shì)類(lèi)似(H-S67R、H-S67K和H-S67H的酶活相對(duì)野生型H-蛋白分別降低了9.3%、6.5%和3.1%)[24]。Tyr-70位點(diǎn)在甘氨酸裂解酶系的整體酶活中也發(fā)揮了重要作用(圖2(b))，與Ser-67位點(diǎn)和Asp-68位點(diǎn)不同的是，當(dāng)Tyr-70位點(diǎn)突變?yōu)閹д姷陌被釙r(shí)，突變體的甘氨酸裂解酶系整體酶活相對(duì)野生型均沒(méi)有降低，其中H-Y70R突變體的整體酶活相較于野生型提高了75.6%。

*P<0.05，** P<0.01，n.s.表示P>0.05，下同。

2.2 H- 蛋白Asp- 68和Tyr- 70位非極性突變結(jié)果

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)H-蛋白空腔內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基Ser-67位點(diǎn)突變?yōu)榉菢O性側(cè)鏈氨基酸殘基后，大部分突變體的酶活相較于野生型呈現(xiàn)提高的趨勢(shì)[24]。在本研究中我們繼續(xù)開(kāi)展Asp-68和Tyr-70的非極性突變研究，將Asp-68和Tyr-70分別突變?yōu)楦拾彼?Gly)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)和亮氨酸(Leu)這4種非極性氨基酸，其中，Asp-68對(duì)應(yīng)的突變體分別記為H-D68G、H-D68V、H-D68M和H-D68L，Tyr-70對(duì)應(yīng)的突變體分別記為H-Y70G、H-Y70V、H-Y70M和H-Y70L，分析突變前后甘氨酸裂解酶系的整體酶活變化。

2.2.1蛋白表達(dá)與純化結(jié)果

圖3(a)和3(b)分別為68位非極性殘基突變體和70位非極性殘基突變體的SDS-PAGE結(jié)果。通過(guò)異源表達(dá)及蛋白純化，野生型H-蛋白、Asp-68位非極性殘基突變體和Tyr-70位非極性殘基突變體均呈現(xiàn)均一條帶，表明蛋白表達(dá)及純化成功，其純度滿(mǎn)足酶活測(cè)定要求。圖3中H蛋白突變體和野生型H-蛋白的條帶位置差異主要是由于H-蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，在電泳之前的沸水滅活處理不能使蛋白三維結(jié)構(gòu)被完全破壞[26]。

圖3 野生型H-蛋白、H蛋白68位非極性殘基突變體和H蛋白70位非極性殘基突變體的SDS-PAGE結(jié)果

2.2.2甘氨酸裂解酶系酶活測(cè)定結(jié)果

分別測(cè)定野生型H-蛋白、Asp-68位非極性殘基突變體和Tyr-70位非極性殘基突變體的甘氨酸酶系整體酶活，結(jié)果如圖4所示。圖4(a)中，除H-D68L外，Asp-68位非極性殘基突變體的甘氨酸裂解酶系整體酶活相對(duì)于野生型H-蛋白均沒(méi)有下降，H-D68G突變體的整體酶活相對(duì)野生型H-蛋白提高了53.6%。圖4(b)中，Tyr-70位點(diǎn)的4個(gè)非極性突變體的整體酶活相較于野生型均沒(méi)有下降，H-Y70V和H-Y70L突變體的酶活相較于野生型分別提高了87%和146%。以上結(jié)果表明，將氨甲基掉落過(guò)程的潛在關(guān)鍵極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸后，甘氨酸酶系的整體酶活變化總體上傾向于維持或提升，僅H-D68L突變體對(duì)整體酶活不利。

2.3 酶活變化機(jī)制分析

為了進(jìn)一步在分子層面上理解正電突變和非極性突變對(duì)酶活的影響，我們選擇酶活變化比較明顯的H-蛋白突變體：H-D68R、H-D68G和H-Y70R、H-Y70L作為研究對(duì)象，建立突變體蛋白模型并分析突變前后硫辛酰胺與H-蛋白空腔內(nèi)的氨基酸相互作用的變化，結(jié)果如圖5所示。野生型H-蛋白的Asp-68殘基會(huì)與硫辛酰胺中氨甲基的氮原子形成氫鍵相互作用，當(dāng)D68殘基突變?yōu)镽68后，其側(cè)鏈氨基酸殘基帶正電，與同樣帶正電的氨甲基產(chǎn)生靜電斥力。由于突變后的R68殘基空間位置處于氨甲基基團(tuán)的下方，此方向的靜電斥力依然使硫辛酰胺難以掉落，且R68殘基側(cè)鏈更長(zhǎng)，靜電斥力存在的時(shí)間較長(zhǎng)。在這種情況下，硫辛酰胺在H-蛋白空腔內(nèi)的運(yùn)動(dòng)會(huì)受到長(zhǎng)時(shí)間的阻礙，硫辛酰胺的釋放速度會(huì)進(jìn)一步減慢，導(dǎo)致甘氨酸裂解酶系的整體酶活降低。當(dāng)D68突變?yōu)镚68后，野生型H-蛋白中原有的氫鍵相互作用消失，這一過(guò)程中硫辛酰胺的釋放不受68位氨基酸的影響，而且甘氨酸側(cè)鏈僅有一個(gè)氫原子，占據(jù)的空間更小，H-蛋白的空腔體積由野生型的490 ?3擴(kuò)大至560 ?3，有助于硫辛酰胺的釋放，使得甘氨酸裂解酶系的整體酶活上升。Tyr-70位點(diǎn)位于H-蛋白空腔的邊緣位置，在硫辛酰胺掉落過(guò)程中會(huì)與之形成氫鍵，從而影響硫辛酰胺離開(kāi)疏水空腔。當(dāng)Y70突變?yōu)镽70后，相互作用由氫鍵變?yōu)殪o電斥力。與Asp-68位點(diǎn)不同的是，70位氨基酸殘基在空間位置上處于氨甲基基團(tuán)的上方，此方向的靜電斥力會(huì)促進(jìn)硫辛酰胺的釋放，引起甘氨酸裂解酶系的整體酶活上升。當(dāng)Y70突變?yōu)長(zhǎng)70時(shí)，非極性氨基酸Leu與硫辛酰胺的氨甲基無(wú)法形成相互作用，原有的氫鍵相互作用消失，有利于硫辛酰胺的釋放。Leu側(cè)鏈在空間位置上朝向空腔外部，占據(jù)的空腔體積小，空腔體積由野生型的490 ?3擴(kuò)大至558 ?3，使得硫辛酰胺在空腔內(nèi)的活動(dòng)范圍變大，進(jìn)一步促進(jìn)硫辛酰胺的釋放，使甘氨酸裂解酶系的整體酶活提高。

3 結(jié)論

本文對(duì)T-蛋白誘導(dǎo)H-蛋白釋放硫辛酰胺過(guò)程的潛在關(guān)鍵氨基酸殘基Asp-68和Tyr-70進(jìn)行了系統(tǒng)突變，探究Asp-68和Tyr-70位點(diǎn)對(duì)甘氨酸裂解酶系整體酶活的影響。結(jié)果表明，當(dāng)Asp-68突變?yōu)閹д姷陌被岷?，突變體的整體酶活相對(duì)野生型呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中H-D68R突變體的酶活下降了90.2%。當(dāng)Asp-68突變?yōu)榉菢O性氨基酸后，突變體的整體酶活傾向于維持或提升，其中H-D68G突變體的酶活相較野生型H-蛋白提高了53.6%。Tyr-70突變?yōu)閹д姲被峄蚍菢O性氨基酸后，可維持或提升甘氨酸裂解酶系的整體酶活，其中H-Y70L突變體的酶活相較于野生型提高了146%。突變前后硫辛酰胺與H-蛋白空腔內(nèi)氨基酸的相互作用分析結(jié)果表明，甘氨酸裂解酶系整體酶活的變化是H-蛋白的68和70位殘基的突變阻礙或促進(jìn)硫辛酰胺釋放所導(dǎo)致的。

本研究通過(guò)對(duì)H-蛋白進(jìn)行定向突變，實(shí)現(xiàn)對(duì)甘氨酸裂解酶系整體酶活的調(diào)控，對(duì)于定量調(diào)控甘氨酸裂解酶系的催化效率和深入理解硫辛酰胺的釋放過(guò)程具有重要作用。同時(shí)，為類(lèi)似的多酶體系復(fù)合物(如丙酮酸脫氫酶系和酮戊二酸脫氫酶系)的深入研究和定向改造提供思路。在后續(xù)的研究中，我們將對(duì)硫辛酰胺進(jìn)入H-蛋白空腔過(guò)程的機(jī)制和相互作用的方式進(jìn)行研究，在硫辛酰胺的進(jìn)入與釋放兩方面綜合實(shí)現(xiàn)對(duì)甘氨酸裂解酶系酶活的精準(zhǔn)調(diào)控，為甘氨酸合成的定向改造以及提高C1合成效率提供理論指導(dǎo)。