宋雪梅，宋國(guó)順，梁 琪,*，張 炎，張忠明

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

牦牛乳蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.53%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.64%，平均比荷斯坦牛乳高出1 倍以上，干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.38%[1]，很適宜制作干酪。牦牛乳硬質(zhì)干酪出品率較高、成熟期長(zhǎng)、風(fēng)味濃郁、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。然而干酪是富含蛋白質(zhì)的發(fā)酵食品，其成熟過(guò)程中伴隨著酪蛋白降解而產(chǎn)生的游離氨基酸在干酪中存在的微生物作用下易產(chǎn)生生物胺。生物胺是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的對(duì)人體健康有影響的物質(zhì)，在不同國(guó)家均出現(xiàn)過(guò)因食用不同干酪（如Gouda、Swiss、Cheddar、Gruyere、Cheshire）而引起生物胺中毒的報(bào)道[2-3]。

不同干酪中各生物胺含量變化范圍較大[4]。干酪中生物胺種類和含量因其制作原料乳種類、工藝、成熟時(shí)間、干酪中微生物等而存在較大差異[5]。目前，生物胺引起人體中毒的限量因個(gè)體而異，很難建立統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn)[6]，除了對(duì)魚中組胺含量有規(guī)定外，對(duì)乳及其制品沒有強(qiáng)制規(guī)定生物胺最高限量。

生物胺是一定環(huán)境條件下，微生物氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸所形成。干酪中具有氨基酸脫羧酶活性的微生物對(duì)生物胺形成起著重要作用，這些微生物源自制作干酪的發(fā)酵劑或者生產(chǎn)過(guò)程中的污染菌[7]。乳酸菌是干酪中組胺和酪胺的主要生產(chǎn)者[4]。干酪中非發(fā)酵劑產(chǎn)生的生物胺含量高于乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種產(chǎn)生的[8]。Ladero等[9]運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法對(duì)乳制品中產(chǎn)胺菌株定量檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌、短乳桿菌、彎曲乳桿菌和乳酸乳桿菌與腐胺積累相關(guān)。Shalaby等[10]發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌和瑞士乳桿菌脫羧酶作用于組氨酸產(chǎn)生組胺。因此，通過(guò)分析干酪中微生物群落結(jié)構(gòu)，有助于了解生物胺形成機(jī)理。

目前，對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)降解及品質(zhì)研究較多[11-12]，但是關(guān)于干酪成熟過(guò)程中生物胺的動(dòng)態(tài)變化研究鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，研究牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中生物胺的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，同時(shí)解析干酪的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為評(píng)價(jià)牦牛乳硬質(zhì)干酪質(zhì)量安全和探究生物胺形成的微生物機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳采自天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)；凝乳酶 北京多愛特生物科技有限公司；嗜熱發(fā)酵劑 丹尼斯克（中國(guó)）有限公司；組胺二鹽酸鹽、2-苯乙胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、腐胺二鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、丹磺酰氯、L-脯氨酸、1,7-二氨基庚烷等均為分析純 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）、亮氨酸、水合茚三酮、氯化鎘、乙醚、碳酸氫鈉（分析純）等均為國(guó)產(chǎn)試劑；E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒 美國(guó)OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Life公司。

1.2 儀器與設(shè)備

干酪槽為甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室自制；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HWS26-電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；真空包裝機(jī) 溫州市大江真空包裝機(jī)械有限公司；2998 PDA四元梯度超快速液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；WD-12氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；ETC 811PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Q32866Qubit?3.0熒光計(jì) 美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 干酪制作和取樣

參考劉興龍等[13]的方法制作新鮮牦牛乳硬質(zhì)干酪，真空包裝后，在4 ℃下成熟1～6個(gè)月。按照干酪成熟時(shí)間依次對(duì)其編號(hào)為SR1、SR2、SR3、SR4、SR5和SR6。將不同成熟期的干酪貯藏在－80 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 干酪pH值測(cè)定

參考Jin等[14]的方法測(cè)定pH值。稱取干酪5 g，加入10 mL蒸餾水混合、勻漿后用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.3 干酪中游離氨基酸含量測(cè)定

參考Folkertsma等[15]的方法并作適當(dāng)修改后測(cè)定干酪中游離氨基酸含量。稱取一定量切碎的干酪，按照料液比1∶9加入蒸餾水，研缽研碎，40 ℃下放置1 h，于3 000 r/min離心30 min，再用快速濾紙過(guò)濾。取過(guò)濾液30 μL，用蒸餾水稀釋到1 mL，加入2 mL鎘-茚三酮溶液，84 ℃反應(yīng)5 min。冷卻后，于507 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算干酪中游離氨基酸含量。

1.3.4 干酪中生物胺含量測(cè)定

1.3.4.1 生物胺提取和衍生

參考Innocente等[16]的方法，稱取5 g研磨均勻的干酪于試管中，加入0.1 mol/L鹽酸10 mL和1 mg/mL 1,7-二氨基庚烷100 μL，均質(zhì)2 min后，干酪漿液在12 000 r/min、4 ℃下離心20 min。收集上清液，用同樣方法浸提殘余物，將浸提液混合倒入容量瓶，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL。

吸取1 mL溶液，加入0.5 mL飽和碳酸氫鈉和1 mL（50 mg/mL）丹磺酰氯溶液于能夠密封的試管中，漩渦振蕩30 s后，40 ℃反應(yīng)60 min。之后，加入200 μL的L-脯氨酸（100 mg/mL），漩渦振蕩1 min，在室溫黑暗處反應(yīng)15 min。然后用1 mL乙醚萃取，4 ℃下離心3 min（3 000 r/min），吸取上層有機(jī)溶液，重復(fù)離心1 次，兩次離心所得有機(jī)溶液層混合并用氮?dú)獯蹈?，將殘留物溶解? mL乙腈中，經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品（組胺、2-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺），加入相同的1,7-二氨基庚烷內(nèi)標(biāo)，按照上述方法進(jìn)行衍生，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 色譜條件

參考Moret等[17]的方法并適當(dāng)調(diào)整后利用高效液相色譜儀測(cè)定生物胺含量。色譜柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫條件：0 min，65% B；1 min，65% B；10 min，80% B；14 min，80% B；21 min，100% B；30 min，100% B。

1.3.5 DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)定

利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒提取樣品中總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，Qubit定量檢測(cè)DNA樣本濃度。擴(kuò)增16S rRNA基因V3～V4高變異區(qū)。通用引物分別為341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）。PCR擴(kuò)增兩輪，第一輪PCR擴(kuò)增體系（30 μL）：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、341F和805R各1 μL、10～20 ng模板DNA、9～12 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，循環(huán)5 次；之后，94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s，循環(huán)20 次；最后72 ℃延伸5 min；第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物，其體系除模板DNA為20～30 ng之外，其余與第一輪相同。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s，循環(huán)5 次；之后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物純化回收后，構(gòu)建文庫(kù)，最后進(jìn)行高通量測(cè)序和分析（由生工生物工程（上海）股份有限公司協(xié)助完成）。

1.3.6 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt軟件去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后使用PRINSEQ切除reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，最終過(guò)濾掉低復(fù)雜度序列，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

1.3.7 OTU聚類和物種注釋

使用Usearch軟件，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，聚類過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU代表序列，然后，使用RDP classifier比對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種進(jìn)行分類注釋，最終分別在門、綱、目、科、屬等分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)處理重復(fù)3 次，理化數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，利用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Pearson相關(guān)性分析，利用Excel 2007軟件進(jìn)行作圖。使用Mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，利用R軟件中的vegan package進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中pH值和游離氨基酸含量的變化

pH 4.0～5.5對(duì)某些氨基酸脫羧酶活性具有重要影響。從表1可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中pH值變化趨勢(shì)平緩，pH值均在5.2～5.5，這為干酪中生物胺的形成提供了有利環(huán)境。游離氨基酸是制約生物胺形成的重要因素，如組氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶的產(chǎn)生緊密依賴于游離氨基酸含量，且受到微生物生長(zhǎng)階段的調(diào)控[18]。如表1所示，在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中，牦牛乳硬質(zhì)干酪中游離氨基酸含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且成熟6個(gè)月干酪中游離氨基酸含量比成熟1個(gè)月干酪顯著高出75.32%（P＜0.05）。

表1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中pH值和游離氨基酸含量的變化Table 1 Changes in pH and total free amino acid contents in hard cheese made from yak’s milk during ripening

2.2 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中生物胺含量的變化

預(yù)實(shí)驗(yàn)中利用高效液相色譜分別確定了組胺、2-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、精胺和亞精胺等出峰時(shí)間。在測(cè)定牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺時(shí)，未檢測(cè)出色胺、精胺和亞精胺，因此，后續(xù)以2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺這5 種生物胺為標(biāo)準(zhǔn)品，以不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰面積和質(zhì)量濃度之比分別作為因變量與自變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別為y=0.085 5x－0.014 4（R2=0.977 3）、y=0.158 1x－0.001 9（R2=0.999 4）、y=0.142x－0.000 5（R2=0.999 7）、y=0.121 4x+0.019 6（R2=0.997 7）和y=0.111 6x+0.002 1（R2=0.999 0）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出干酪樣品中各生物胺含量。不同成熟期牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺含量變化如圖1所示。

圖1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中生物胺含量的變化Fig. 1 Changes in the contents of biogenic amines in hard cheese made from yak’s milk during ripening

從圖1可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪中的生物胺主要為腐胺、2-苯乙胺、酪胺、組胺和尸胺，這與大多數(shù)干酪中生物胺種類相同[19]。干酪中生物胺含量最高階段均出現(xiàn)在成熟后期5～6個(gè)月，這說(shuō)明成熟期長(zhǎng)的干酪含有較高生物胺含量，在大多數(shù)干酪品種中也存在類似現(xiàn)象。因此，成熟時(shí)間是導(dǎo)致生物胺積累的重要因素之一。

牦牛乳硬質(zhì)干酪在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中，其生物胺含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但是不同生物胺含量增長(zhǎng)趨勢(shì)不同。2-苯乙胺和腐胺含量在前4個(gè)月成熟過(guò)程中增加緩慢，之后急劇增加，第6個(gè)月時(shí)，其含量最高。成熟6個(gè)月干酪中2-苯乙胺和腐胺含量分別是成熟4個(gè)月干酪中2-苯乙胺、腐胺含量的3.73 倍和3.06 倍，且兩者間差異顯著（P＜0.05）。尸胺在1～4個(gè)月成熟過(guò)程中含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，第4個(gè)月時(shí)，尸胺含量達(dá)到最高，隨后小幅度降低后再升高，但是成熟6個(gè)月干酪中尸胺含量與成熟4個(gè)月干酪中差異不顯著（P＞0.05）。2-苯乙胺是二胺氧化酶和組胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。腐胺和尸胺含量的增多不但會(huì)影響干酪風(fēng)味，還會(huì)通過(guò)抑制組胺氧化酶活性增強(qiáng)組胺毒性[20]。因此，需注意對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪中2-苯乙胺、腐胺和尸胺進(jìn)行控制。

組胺和酪胺是兩種毒性相對(duì)較大的生物胺。牦牛乳硬質(zhì)干酪中組胺在1～5個(gè)月成熟過(guò)程中含量呈現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì)，成熟5個(gè)月時(shí)其含量達(dá)到最高,且與其他不同成熟階段的干酪存在顯著差異（P＜0.05）。干酪中酪胺在1～4個(gè)月成熟過(guò)程中含量呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢(shì)，之后，其含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，酪胺在成熟6個(gè)月干酪中含量最高，是成熟3個(gè)月干酪的1.99 倍，但是與成熟5個(gè)月干酪沒有顯著差異（P＞0.05）。成熟5個(gè)月干酪中組胺含量為（16.78±3.68）mg/kg，遠(yuǎn)低于美國(guó)食品藥品管理規(guī)定的食品中組胺含量限量（不超過(guò)50 mg/kg）。成熟6個(gè)月干酪中酪胺含量為（62.33±6.11）mg/kg，也低于Brink等[21]建議的酪胺安全劑量（100～800 mg/kg）。

酪胺和腐胺是干酪中常見的、濃度較高的生物胺[22-23]，然而不同畜種乳制作的不同干酪中生物胺存在差異。Caciotta牛乳干酪中主要生物胺是腐胺和尸胺；Pecorino綿羊乳干酪中主要生物胺是酪胺和尸胺[24]。Lanciotti等[25]發(fā)現(xiàn)成熟末期綿羊乳干酪中生物胺含量為850 mg/kg。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牦牛乳硬質(zhì)干酪中腐胺為主要生物胺，在1～6個(gè)月成熟過(guò)程，平均占總生物胺含量的50.01%。不同成熟期干酪的總生物胺含量低于（448.29±9.56）mg/kg。Spanjer等[26]建議干酪中酪胺、組胺、腐胺和尸胺總含量不應(yīng)超過(guò)900 mg/kg，Taylor等[27]認(rèn)為生物胺總含量低于1 000 mg/kg的食品是安全的。因此，從干酪中組胺、酪胺和總生物胺含量來(lái)看，牦牛乳硬質(zhì)干酪處于安全范圍內(nèi)。

2.3 牦牛乳硬質(zhì)干酪中各生物胺、游離氨基酸含量和成熟時(shí)間之間的相關(guān)性分析

生物胺的積累依賴于對(duì)氨基酸的有效利用。由表2可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪中游離氨基酸含量和各生物胺含量、成熟時(shí)間之間存在正相關(guān)關(guān)系，其中游離氨基酸含量與腐胺含量、尸胺含量和總生物胺含量間均呈極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），與2-苯乙胺、酪胺含量呈顯著正相關(guān)性（P＜0.05），這說(shuō)明干酪中游離氨基酸含量對(duì)生物胺形成具有重要影響。在其他干酪研究中也得到類似結(jié)果[5]。成熟時(shí)間與游離氨基酸含量、各生物胺含量之間也具有較強(qiáng)正相關(guān)性，這進(jìn)一步說(shuō)明成熟時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致生物胺的積累。干酪中各生物胺含量之間存在正相關(guān)性，其中組胺含量和酪胺含量間呈顯著正相關(guān)性（P＜0.05），2-苯乙胺含量與腐胺、尸胺、酪胺含量之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），腐胺含量與尸胺、酪胺含量間以及尸胺含量和酪胺含量間也呈極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），這說(shuō)明生物胺的形成具有一定同源性。

表2 牦牛乳硬質(zhì)干酪中各生物胺、游離氨基酸含量和成熟時(shí)間之間的相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation coefficients between ripening time and the contents of total free amino acids and biogenic amines in hard cheese made from yak’s milk

2.4 牦牛乳硬質(zhì)干酪中細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是反映一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，主要通過(guò)Chao1、ACE等豐富度估計(jì)指數(shù)和Shannon、Simpson等多樣性指數(shù)來(lái)體現(xiàn)。從表3可以看出，Shannon指數(shù)在牦牛乳硬質(zhì)干酪1～4個(gè)月成熟過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在第5個(gè)月時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，之后又呈下降趨勢(shì)。這表明干酪的微生物多樣性在成熟過(guò)程中呈現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)。這主要由于是牦牛乳硬質(zhì)干酪采用了真空包裝，干酪處于厭氧狀態(tài)中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和干酪中基質(zhì)環(huán)境變化，部分微生物的生長(zhǎng)繁殖受到抑制。另外，所有樣品Coverage指數(shù)接近1，表明使用的抽樣方案已經(jīng)基本覆蓋了樣本中所有細(xì)菌，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

表3 牦牛乳硬質(zhì)干酪中菌落的Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha-diversity indexes of bacterial community in cheese samples

2.5 牦牛乳硬質(zhì)干酪中細(xì)菌群落Beta多樣性分析

Beta多樣性是用來(lái)比較不同生態(tài)系統(tǒng)間群落的多樣性。通過(guò)可視化的PCoA圖能夠觀察和體現(xiàn)個(gè)體或群體間差異。本實(shí)驗(yàn)利用基于Bray-Curits的PCoA圖解析不同成熟期牦牛乳硬質(zhì)干酪樣品的細(xì)菌群落差異。

由圖2可知，第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為64.92%、28.26%。成熟1～6個(gè)月的干酪樣品分布在4個(gè)區(qū)域。成熟2～4個(gè)月干酪樣品在相同區(qū)域，說(shuō)明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，成熟1、5、6個(gè)月干酪樣品分別分布在不同區(qū)域，且與其他樣品距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異。這種差異也反映在不同成熟期干酪中生物胺的含量差異上。

圖2 不同成熟期牦牛乳硬質(zhì)干酪樣品的主坐標(biāo)分析Fig. 2 Principal co-ordinates analysis of cheese samples made from yak’s milk at different ripening periods

2.6 牦牛乳硬質(zhì)干酪中細(xì)菌群落在門和屬分類水平的分析

為進(jìn)一步了解不同成熟期牦牛乳硬質(zhì)干酪中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，在門和屬水平對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分類分析。從圖3可知，所有測(cè)試樣品包括兩個(gè)門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），厚壁菌門相對(duì)豐度在84%以上，為優(yōu)勢(shì)菌門。在1～6個(gè)月干酪成熟中，厚壁菌門相對(duì)豐度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，變形菌門相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)。

圖3 牦牛乳硬質(zhì)干酪中細(xì)菌組成在門水平上的相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of bacterial phyla in cheese samples made from yak’s milk

由圖4可知，成熟1～6個(gè)月的牦牛乳硬質(zhì)干酪包含鏈球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、拉烏爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬7個(gè)屬和無(wú)分類的腸桿菌科。不同成熟期干酪中鏈球菌屬相對(duì)豐度均高于79.6%，其平均相對(duì)豐度為84.63%，為主要優(yōu)勢(shì)菌群，這與干酪制作過(guò)程中加入的發(fā)酵劑有關(guān)，其次為明串珠菌屬，其平均相對(duì)豐度為6.91%，乳桿菌屬平均相對(duì)豐度為3.97%，是干酪中第三優(yōu)勢(shì)菌群。

圖4 牦牛乳硬質(zhì)干酪中細(xì)菌組成在屬水平上的相對(duì)豐度Fig. 4 Relative abundance of bacterial genera in cheese samples made from yak’s milk

明串珠菌屬、拉烏爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度在牦牛乳硬質(zhì)干酪1～3個(gè)月成熟過(guò)程中呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，在3～6個(gè)月成熟過(guò)程中，3個(gè)屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。明串珠菌屬相對(duì)豐度在第5個(gè)月時(shí)最高。干酪中腸桿菌屬，除成熟1個(gè)月干酪外，4個(gè)月成熟干酪中相對(duì)豐度最高。假單胞菌屬在干酪1～6個(gè)月成熟過(guò)程中，整體上呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。乳桿菌屬在干酪1～3個(gè)月成熟過(guò)程中，呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，之后，呈現(xiàn)先降低后增加趨勢(shì)，除成熟1個(gè)月干酪外，其平均相對(duì)豐度為4.61%。

一些學(xué)者在各種發(fā)酵劑的某些菌株中發(fā)現(xiàn)了酪氨酸和組氨酸脫羧酶[28-29]。嗜熱鏈球菌被發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)組胺和酪胺能力[30]。鏈球菌屬是牦牛乳硬質(zhì)干酪中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，大量鏈球菌屬的存在對(duì)干酪中生物胺形成的影響作用不容忽視。大腸桿菌科和假單胞菌屬是原料乳中的常見菌，一些菌株含有脫羧酶，能夠產(chǎn)生組胺、尸胺和腐胺。明串珠菌屬的某些菌株也具有產(chǎn)胺能力。乳桿菌屬可能也含有脫羧酶，能夠產(chǎn)生組胺、酪胺、腐胺和尸胺[31]。以上分析進(jìn)一步說(shuō)明了牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺之間的相關(guān)性，同時(shí)表明除拉烏爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬之外，其他菌屬均存在產(chǎn)生物胺的可能性，后續(xù)將進(jìn)一步深入對(duì)干酪中產(chǎn)胺微生物進(jìn)行研究。

腸桿菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬、拉烏爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬一般來(lái)自動(dòng)物乳房、農(nóng)場(chǎng)、擠奶環(huán)境以及與乳直接接觸的擠奶工人和容器[32]。牦牛乳采集于生活在青藏高原的牦牛，擠奶環(huán)境開放，擠奶方式為傳統(tǒng)的手工擠奶。雖然在牦牛乳硬質(zhì)干酪制作過(guò)程中使用了熱處理，但是原料乳中部分微生物仍能夠存活并在干酪成熟過(guò)程中進(jìn)行新陳代謝[33-34]，很可能參與到干酪中生物胺的形成中[35]。Nout等[36]認(rèn)為生物胺含量低于100～200 mg/kg的食品可被消費(fèi)者接受，因此，為了確保牦牛乳硬質(zhì)干酪優(yōu)質(zhì)品質(zhì)，需要重視擠奶環(huán)節(jié)，提高原料乳質(zhì)量。

3 結(jié) 論

牦牛乳硬質(zhì)干酪中主要生物胺為腐胺、2-苯乙胺、酪胺、組胺、尸胺。干酪中各種生物胺含量在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。干酪中生物胺含量最高階段均出現(xiàn)在成熟后期5～6個(gè)月。干酪中組胺、酪胺和總生物胺含量分別低于推薦安全劑量50、100 mg/kg和1 000 mg/kg。干酪中游離氨基酸含量與除組胺之外的各生物胺含量、總生物胺含量、成熟時(shí)間具有顯著正相關(guān)性（P＜0.01，P＜0.05），各生物胺含量之間也存在正相關(guān)性。不同成熟期干酪包含鏈球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、拉烏爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬7個(gè)屬和無(wú)分類的腸桿菌科。鏈球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，其平均相對(duì)豐度為84.63%；明串珠菌屬次之，其平均相對(duì)豐度為6.91%，本研究為評(píng)估牦牛乳硬質(zhì)干酪的質(zhì)量安全性和生物胺形成機(jī)理提供了依據(jù)。