梅 璇， 吳海聰， 林 靜， 鄭嬌龍， 劉 邦， 李東良

解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院(福建醫(yī)科大學福總臨床醫(yī)學院) 肝膽內(nèi)科， 福州 350025

原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石(primary intrahepatic lithiasis，PIL)是指發(fā)生于左右肝管分叉部以上的肝內(nèi)各級分支膽管內(nèi)的結(jié)石，屬于原發(fā)性膽管結(jié)石的一種[1]。肝內(nèi)膽管解剖結(jié)構(gòu)的復雜性及結(jié)石大小、數(shù)量的多樣性，易誘發(fā)反復膽道感染，長期發(fā)展可繼發(fā)膽汁性肝硬化以及膽管癌等嚴重并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活和生存質(zhì)量[2]。由于其發(fā)病機制尚未完全闡明，迄今仍缺乏滿意的治療藥物和有效的預防方法[3]。流行病學研究[4]顯示，不同種族、不同國家和地區(qū)人群該病發(fā)病率存在較大差異，這一現(xiàn)象提示PIL具有遺傳易感性。因此，對易感基因篩查和功能研究已成為近年來關(guān)于PIL研究的一個重要方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年6月—2018年11月于本院門診或住院的PIL患者作為病例組，并篩選同期健康體檢者作為對照組。納入標準：病例組患者診斷標準符合2016年《歐洲肝病學會臨床實踐指南：膽石病的預防、診斷和治療》[11]。對照組為與病例組無血緣關(guān)系的非PIL的健康體檢者。排除標準：(1)排除進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥、良性再發(fā)型肝內(nèi)膽汁淤積癥、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥等相關(guān)膽汁淤積性疾??；(2)排除膽囊結(jié)石及肝外膽管結(jié)石患者；(3)排除病毒性肝病(包括 HAV、HBV、HCV、EBV、CMV 和單純皰疹病毒感染)；(4)排除有嚴重免疫缺陷者；(5)與已入組的病例或?qū)φ杖巳河杏H緣關(guān)系者；(6)臨床資料不完整的病例。

1.2 資料收集 用EDTAK2抗凝管收集研究對象外周血4 mL用于基因組DNA提取。資料采集內(nèi)容包括：研究對象基本資料，肝內(nèi)膽管結(jié)石情況，影像學檢查結(jié)果，診療方法及療效，既往病史等信息。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要試劑和儀器 2xTaq Master Mix(美國Vazyme公司)；引物(上海擎科生物工程有限公司)；基因組DNA提取試劑盒(美國omega公司)；臺式高速離心機(德國 Eppendorf 公司)；ND-1000 紫外分光光度計(上海譜元儀器有限公司)；PCR 9700型擴增儀(美國ABI公司)；電泳儀(上海Tanon公司)；凝膠成像儀(上海Tanon公司)；3730XL測序儀(美國ABI公司)。

1.3.2 基因組DNA提取 采用美國omega公司的基因組DNA提取試劑盒，按照操作說明書提取外周血細胞中的基因組DNA，具體步驟參照產(chǎn)品說明書。應(yīng)用紫外分光光度法對提取的基因組DNA的濃度及純度進行測定。

1.3.3 基因位點的選擇 以 CFTR基因作為本研究的目的基因，從Pubmed數(shù)據(jù)庫中的文獻、UCSC數(shù)據(jù)庫中篩選并確定在國人中與疾病密切相關(guān)的Poly-T、TG-repeats和M470V位點為目標位點。

1.3.4 基因型鑒定 利用UCSC人類基因組數(shù)據(jù)庫的In-Silico PCR工具確定引物序列(表1)。上海擎科生物工程有限公司進行引物合成及目標位點PCR擴增。將擴增產(chǎn)物送至上海歐易生物科技公司進行測序。

表1 CFTR基因3個位點正反向引物

1.4 倫理學審查 本研究通過解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院倫理委員會批準，批號：2018-021，所有研究對象均簽屬知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入PIL患者104例，男34例，女70例，平均(59.32±14.35)歲。對照組120例，男72例，女48例，平均(48.47±12.65)歲。2組研究對象年齡、性別差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表2)。

2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗 PIL組3個位點及對照組TG-repeat、Poly-T位點基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P值均>0.05)。對照組M470V位點上基因型頻率偏離Hardy-Weinberg 平衡(χ2=17.59，P<0.05)。

因此，采用ORadj表示基因型與發(fā)病風險的關(guān)系。經(jīng)平衡校正后，攜帶有等位基因G的個體(AG、GG)較AA純合型個體發(fā)生PIL的風險升高(OR>1)，隨著等位基因G的個數(shù)增加，患病風險逐漸升高(ORGG：4.68>ORAG：2.50)(表3)。

表2 研究對象的一般資料

表3 PIL組與對照組M470V位點基因型比較

表4 PIL組和對照組3個位點等位基因分布

表5 PIL組和對照組3個位點基因型分布

表6 PIL組和對照組TG-repeat、Poly-T多態(tài)性位點的單倍體基因型分布

2.3 CFTR基因中三個多態(tài)性位點的等位基因及基因型分布 PIL組和對照組間3個位點的基因分析結(jié)果顯示：M470V位點上的等位基因(χ2=15.139，P<0.01)和基因型(χ2=22.889，P<0.01)在2組間差異均有統(tǒng)計學意義。TG-repeat、Poly-T兩位點上等位基因及個體基因型在2組間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表4、5)。

2.4 CFTR基因多態(tài)性與PIL的關(guān)系 M470V位點上，等位基因G攜帶者的PIL發(fā)病風險升高(OR=2.108，P<0.01)(表4)。TG-repeats位點上，12TG/13TG基因型個體發(fā)生PIL的風險較11TG/12TG基因型個體升高(OR=11.002，P<0.05)。Poly-T位點上，7T/5T基因型個體發(fā)生PIL的風險較7T/7T基因型個體降低(OR=0.079，P<0.05)(表5)。

2.5 CFTR基因TG-repeat、Poly-T兩個多態(tài)性位點的單倍體基因型分析 11TG-7T、12TG-7T單倍體基因型在PIL患者當中所占比例最高，分別為45.2%和51.0%。TG-repeats和Poly-T位點的各種單倍體基因型在PIL組和對照組間頻率差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表6)。

3 討論

此前，在其他疾病中已證實TG-repeats、Poly-T位點多態(tài)性與疾病表型相關(guān)[20]。TG-repeats是位于CFTR基因核苷酸鏈上內(nèi)含子8與外顯子9之間的一段TG堿基重復序列，參與內(nèi)含子8與外顯子9的剪接，TG重復序列越長，功能正常的CFTR蛋白數(shù)量越少[19]。在本研究中，12TG/13TG基因型個體的PIL易感性比11TG/12TG個體更高(OR=11.002，P<0.05)。這與Salinas等[21]在非PIL疾病研究中發(fā)現(xiàn)TG重復序列越長越容易致病的研究結(jié)果一致。Poly-T是與位點TG-repeats緊鄰的T堿基重復序列，堿基T重復次數(shù)越少，正常的CFTR蛋白數(shù)量越少[9]。Jiang等[22]研究認為IVS8-5T是慢性胰腺炎的危險因素。反之，Qiao等[23]卻發(fā)現(xiàn)5T在前列腺癌發(fā)病過程中起保護作用。在本研究中，7T/5T個體較7T/7T發(fā)生PIL的風險更低(OR=0.079,P=0.047)。不同種族及地域人群的CFTR基因多態(tài)性存在差異[4]，因此，本研究與既往部分研究結(jié)果不相符可能是由于納入的研究對象遺傳背景不同所致。

本研究目前僅局限于基因?qū)用?，尚無蛋白質(zhì)分子水平的證據(jù)，即使基因異常卻仍有可能出現(xiàn)編碼蛋白不致病可能，因此需進一步對CFTR基因參與的信號通路及編碼的蛋白產(chǎn)物加以研究探索。另外，本研究為單中心研究，樣本量有限，難免存在選擇偏倚，研究結(jié)果未來還需在更大樣本量及不同種族、地域人群中進行驗證。

肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病不是單一因素所致，而是由多因素共同作用。本研究結(jié)果證實了漢族人群中CFTR基因的M470V位點和PIL易感性之間的相關(guān)性。然而目前CFTR基因多態(tài)性在PIL發(fā)病過程中的分子作用機制尚未完全明確。未來仍需進一步的研究來闡釋其多態(tài)性在PIL中的具體致病機制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：梅璇負責課題設(shè)計、研究實施、數(shù)據(jù)分析以及論文撰寫；吳海聰、林靜負責資料收集、數(shù)據(jù)分析；鄭嬌龍、劉邦負責數(shù)據(jù)整理；李東良負責課題設(shè)計、研究指導、論文修改。