王成康， 劉壽榮

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院 感染科， 浙江 義烏 322000； 2 杭州市西溪醫(yī)院 肝病科， 杭州 310023

全球有超過(guò)2.4億慢性HBV感染者，若不及時(shí)進(jìn)行有效、規(guī)范的治療，15%～40%的患者會(huì)進(jìn)展為肝硬化，最終導(dǎo)致肝衰竭和肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。雖然乙型肝炎疫苗的接種使HBV感染的患病率逐年下降，但多數(shù)亞洲地區(qū)仍歸為中至高流行區(qū)。我國(guó)HBsAg流行率為5%～6%，但因?yàn)槿丝诨鶖?shù)大，所以仍存在許多的慢性HBV感染者，其中需要治療的慢性乙型肝炎(CHB)患者約有2000萬(wàn)～3000萬(wàn)[2-3]；因此慢性HBV感染依然是我國(guó)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。當(dāng)前用于抗病毒治療的核苷(酸)類(lèi)似物(nucleos(t)ide analogues,NAs)雖可有效抑制病毒復(fù)制，延緩疾病進(jìn)展，但對(duì)肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)均無(wú)明確作用，使得病毒無(wú)法完全清除。cccDNA作為HBV復(fù)制的原始模板，檢測(cè)肝內(nèi)cccDNA水平是評(píng)價(jià)抗病毒療效及停止治療的重要指標(biāo)[4-5]，由于肝活檢為侵入性操作，cccDNA在肝組織內(nèi)分布不均，松弛環(huán)狀雙鏈DNA(relaxed circularDNA，rcDNA)的存在影響cccDNA含量等因素導(dǎo)致cccDNA檢測(cè)難以在臨床廣泛開(kāi)展[6-7]。因此需要尋找能反映肝內(nèi)cccDNA活性且方便操作的臨床替代指標(biāo)。近年來(lái)HBV RNA作為新的血清學(xué)標(biāo)志物被廣泛提出，因?yàn)槠渲荒軄?lái)自肝內(nèi)cccDNA,所以能更好的反映HBV轉(zhuǎn)錄活性，本研究主要探討血清HBV RNA在HBeAg陽(yáng)性CHB患者不同時(shí)期的表達(dá)水平及檢測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年8月—2020年12月在杭州市西溪醫(yī)院肝病科門(mén)診及住院部診治的CHB患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[8]；(2)準(zhǔn)備接受或已接受NAs抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并HAV、HCV、巨細(xì)胞病毒等其他嗜肝病毒感染；(2)合并HIV感染；(3)HCC患者；(4)代謝性肝病、自身免疫性肝病及近期使用肝損傷性藥物者；(5)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤或嚴(yán)重疾病者；(6)研究者認(rèn)為不適合入組的其他情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 本研究使用的HBV RNA定量檢測(cè)試劑盒由湖南圣湘科技有限公司提供，檢測(cè)原理通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄HBV核酸中的pgRNA(經(jīng)DNA酶消化)，利用針對(duì)HBV pgRNA序列設(shè)計(jì)的一組特異性引物與熒光探針，配以PCR反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀上，應(yīng)用一步法RT實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)HBV pgRNA的定量檢測(cè)，HBV RNA檢測(cè)下限為50 拷貝/mL。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法在美國(guó)雅培Alinity i全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上行HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)；用HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒，在ABI7500熒光定量PCR儀上行HBV DNA檢測(cè)；HBV DNA檢測(cè)下限為30 IU/mL；用Beckman Coulter AU5831全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT(正常范圍9～50 U/L)、AST(正常范圍15～40 U/L)。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)杭州市西溪醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào)：2019年(科)倫審第21號(hào)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入61例CHB患者，平均年齡(39.95±9.88)歲。按HBeAg及HBV DNA狀態(tài)分為3組：HBeAg陽(yáng)性CHB[HBeAg(+)、HBV DNA(+)]未治患者，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換前[HBeAg(+)、HBV DNA(-)]經(jīng)治患者，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換后[HBeAg(-)、HBV DNA(-)]經(jīng)治患者(表1)。

表1 納入患者分組情況及基線(xiàn)資料

2.2 不同時(shí)期血清HBV RNA的表達(dá)水平 HBeAg陽(yáng)性CHB未治患者血清HBV RNA陽(yáng)性率100%(22/22)，HBV RNA載量最大值為9 log10拷貝/mL，平均為7 log10拷貝/mL；HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換前經(jīng)治患者血清HBV RNA陽(yáng)性率88.2%(15/17)，HBV RNA載量最大值為5 log10拷貝/mL，平均4 log10拷貝/mL；HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換后經(jīng)治患者血清HBV RNA陽(yáng)性率22.7%(6/22)，HBV RNA載量最大值為4 log10拷貝/mL。

2.3 經(jīng)治HBeAg陽(yáng)性組與HBeAg陰性組血清學(xué)指標(biāo)比較 經(jīng)治HBeAg陽(yáng)性組的HBV RNA陽(yáng)性率顯著高于HBeAg陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),2組間HBV RNA、HBsAg水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

2.4 HBV DNA陽(yáng)性組與HBV DNA陰性組血清學(xué)指標(biāo)比較 CHB患者NAs治療實(shí)現(xiàn)HBV DNA陰轉(zhuǎn)時(shí)，肝功能復(fù)常，ALT、AST水平降低，HBV RNA、HBsAg水平也均有所降低(P值均<0.001)(表3)。對(duì)于治療后HBV DNA陰轉(zhuǎn)的CHB患者，Spearman相關(guān)分析示，血清HBV RNA與血清HBsAg無(wú)相關(guān)性(P=0.091)。

2.5 不同時(shí)期HBV RNA與HBsAg、HBV DNA的相關(guān)性

在HBeAg陽(yáng)性CHB未治患者中，HBV RNA與HBsAg(r=0.612，P<0.01)、HBV DNA(r=0.922,P<0.01)均具有較強(qiáng)的相關(guān)性(圖1)；在HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換前和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換后的經(jīng)治患者中，HBV RNA與HBsAg無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；3組患者HBV RNA與年齡、ALT、AST均無(wú)相關(guān)性(P值均>0.05)。

圖1 HBeAg陽(yáng)性CHB未治患者HBV RNA與HBsAg、 HBV DNA的相關(guān)性

3 討論

CHB是導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭、HCC的主要危險(xiǎn)因素，每年約有80萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)性疾病[9]，因此如何有效的管理CHB患者仍是當(dāng)前臨床工作的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著對(duì)HBV RNA的研究深入，已知HBV感染患者血清中的HBV RNA就是前基因組RNA(pgRNA)，即3.5 kb mRNA；pgRNA是HBV復(fù)制的中間產(chǎn)物，利用cccDNA作為模板在病毒核衣殼內(nèi)轉(zhuǎn)錄，最后釋放完整的子代病毒，因此血清HBV RNA與HBsAg不同，其只能來(lái)自于肝內(nèi)cccDNA；而NAs是通過(guò)取代HBV復(fù)制過(guò)程中聚合酶區(qū)的核苷來(lái)抑制病毒復(fù)制，并不能影響cccDNA轉(zhuǎn)錄生成mRNA，由此可以推斷HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA相關(guān)，檢測(cè)外周血HBV RNA水平可以反映肝內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。因此相比于HBsAg、HBV DNA等傳統(tǒng)的血清學(xué)指標(biāo)，血清HBV RNA水平可以更好的反映肝內(nèi)病毒復(fù)制水平，其能作為CHB患者管理的新型標(biāo)志物[10-11]。

HBeAg陽(yáng)性CHB患者在接受抗病毒藥物治療后會(huì)逐步實(shí)現(xiàn)HBV DNA陰轉(zhuǎn)、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換等目標(biāo)，本研究通過(guò)觀(guān)察HBeAg陽(yáng)性的CHB患者不同時(shí)期的HBV RNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)未治療的22例CHB患者血清中均能檢測(cè)出較高的血清HBV RNA水平；39例治療后HBV DNA陰轉(zhuǎn)的CHB患者中仍有21例可以檢測(cè)出HBV RNA，這表明在評(píng)估病毒復(fù)制方面HBV RNA比HBV DNA更靈敏，即使是在HBV DNA持續(xù)低于檢測(cè)下限且發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換也有部分患者血清HBV RNA陽(yáng)性，意味HBeAg的消失只能表示病毒復(fù)制減弱，肝內(nèi)cccDNA仍可能存在低水平的轉(zhuǎn)錄。

對(duì)HBeAg陽(yáng)性CHB患者而言，發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換是比較滿(mǎn)意的終點(diǎn)，是發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)的基本條件。本文通過(guò)比較治療后HBV DNA陰轉(zhuǎn)的HBeAg陽(yáng)性組與HBeAg陰性組，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽(yáng)性組HBV RNA陽(yáng)性率顯著高于HBeAg陰性組(88.2% vs 27.3%)，兩組間HBV RNA、HBsAg水平差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因HBV RNA只能來(lái)自于肝內(nèi)cccDNA,提示HBeAg陽(yáng)性CHB患者肝內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性更高。因此臨床上對(duì)HBeAg陽(yáng)性的CHB患者要努力實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

表2 經(jīng)治患者HBeAg陽(yáng)性組與HBeAg陰性組臨床資料比較

表3 HBV DNA陽(yáng)性組與HBV DNA陰性組臨床資料比較

通過(guò)分析HBV DNA陽(yáng)性組與HBV DNA陰性組患者，發(fā)現(xiàn)接受NAs治療后HBV DNA、HBV RNA均會(huì)發(fā)生下降，這是因?yàn)镹As類(lèi)藥物抑制pgRNA的逆轉(zhuǎn)錄，致使DNA合成受阻，而長(zhǎng)時(shí)間接受NAs治療使rcDNA的形成受到抑制，影響cccDNA池的回補(bǔ)，被感染的肝細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)一步導(dǎo)致HBV RNA的生成也減少；另外接受NAs治療的CHB人群在病毒清除的過(guò)程中可能會(huì)促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力從而減少cccDNA池。但是在臨床上發(fā)現(xiàn)即使CHB患者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期NAs抗病毒治療，能實(shí)現(xiàn)完全治愈的患者極為罕見(jiàn)，可能是只需要極少部分逆轉(zhuǎn)錄酶存在活性就能對(duì)cccDNA池進(jìn)行補(bǔ)充，因此對(duì)大部分CHB患者而言需要長(zhǎng)期口服NAs抗病毒治療。

本研究發(fā)現(xiàn)，未接受治療的CHB患者HBV RNA與HBsAg(r=0.612，P<0.01)、HBV DNA(r=0.922,P<0.01)均具有較強(qiáng)的正相關(guān)，這種血清學(xué)間良好的相關(guān)性有助于基層醫(yī)院或者醫(yī)療資源匱乏地區(qū)，使用HBsAg定量水平反映HBeAg陽(yáng)性CHB患者體內(nèi)病毒復(fù)制水平，而另外兩組HBV DNA陰性的CHB患者HBV RNA與HBsAg無(wú)相關(guān)性，這與Mak等[12]的研究結(jié)果一致，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，HBV RNA與HBsAg相關(guān)性逐漸下降，從一定程度反映了治療后的HBsAg水平不能準(zhǔn)確反映肝內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性。

綜上所述，對(duì)未接受抗病毒治療的CHB患者，血清HBV RNA與其他血清學(xué)標(biāo)志物有一定的相關(guān)性，對(duì)NAs治療后HBV DNA陰轉(zhuǎn)的患者有望使用HBV RNA繼續(xù)監(jiān)測(cè)肝內(nèi)病毒復(fù)制活性，為CHB患者長(zhǎng)期抗病毒治療提供依據(jù)。但本研究樣本量較少，相關(guān)結(jié)論有待進(jìn)一步證實(shí)，后續(xù)可以在未治療組繼續(xù)納入合適患者并進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究，觀(guān)察HBeAg陽(yáng)性CHB患者在NAs治療過(guò)程中HBV RNA的動(dòng)態(tài)變化。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王成康負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索，收集數(shù)據(jù)并分析、撰寫(xiě)論文；劉壽榮擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)及修改論文，并最后定稿。