李林昊 孫月華 屈沛杰 楊玉玲 潘 勤

(武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室 & 湖北省過敏及免疫相關(guān)疾病重點實驗室， 湖北 武漢 430071)

模式識別受體識別病原微生物是機體防御病原體入侵的第一道防線，外界病毒、細菌、真菌和寄生蟲等入侵機體時，通常由模式識別受體直接識別這些抗原保守結(jié)構(gòu)成分，即病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。Toll樣受體家族(toll-like receptors, TLRs)是這些模式識別分子中最重要的家族之一，它們在啟動天然免疫反應(yīng)和促進適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)TLRs在多種動物細胞中表達，其中人類表達10種TLRs(TLR1～10)，小鼠表達12種TLRs(TLR1～9, TLR11, TLR12, TLR13)[2]。作為TLRs家族中的重要一員， TLR2已被廣泛研究，并被證實在機體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TLR2表達于免疫細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞等多種細胞中，在炎癥、免疫反應(yīng)、細胞增殖等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。TLR2可與TLR1或TLR6形成功能性異源二聚體，還能與大量非TLR分子相互作用，識別多種PAMPs，包括病毒、真菌、細菌和寄生蟲[5]。TLR2被激活后，通常啟動髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依賴的細胞內(nèi)信號通路，誘導(dǎo)核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)核易位從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生炎癥細胞因子，還可激活絲/蘇氨酸蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)，進而影響炎癥基因轉(zhuǎn)錄[3,6]。免疫細胞TLR2的表達對其發(fā)揮免疫效應(yīng)具有重要作用。如巨噬細胞細胞膜上TLR2的表達可誘導(dǎo)骨架相關(guān)信號分子活化，從而增強巨噬細胞吞噬抗原的作用[7]。研究表明HBV顆粒在體外被B細胞表面的TLR2識別后，B細胞被激活，且HBV可通過TLR2-MyD88-mTOR信號通路激活B細胞并調(diào)控其代謝[8]。本實驗旨在構(gòu)建表達TLR2的重組慢病毒，為進一步研究TLR2在免疫細胞中的作用及機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料儀器和細胞

1.1.1 主要試劑

液體硫乙醇酸鹽肉湯(碧迪醫(yī)療器械有限公司，中國)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)、FBS胎牛血清(Gibco，美國)；胰蛋白酶(Amresco，美國)；Trizol Reagent(Invitrogen，美國)；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、DEPC水(中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo，日本)；小提和大提質(zhì)粒試劑盒(Omega Bio-Tek，美國)；割膠回收試劑盒(AXYGEN公司，美國)；高速連接酶(Ligation Kit-Ligation High)(Toyobo，日本)；重組Anti-TLR2抗體(abcam，英國)；GAPDH單克隆抗體(Proteintech，美國)；HRP羊抗鼠IgG(ABclonal，美國)；ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑(Millipore，美國)。

1.1.2 主要儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；生物安全柜(ESCO，新加坡)；普通PCR擴增儀(Eppendorf，德國)；ECL化學(xué)發(fā)光檢測儀(UVP Bioimaging system，美國)；全自動高壓滅菌鍋(廈門致微公司)；離心機(Eppendorf，德國)；倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)；恒溫搖床(武漢ONGYUE公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.1.3 細胞、菌株及質(zhì)粒

C57BL/6野生型小鼠購自湖北省疾病控制中心。293T細胞、pCDH-CMV-EF1a-GFP-puro質(zhì)粒、psPAX2和pMD2.G輔助質(zhì)粒、大腸桿菌感受態(tài)E. coli DH5α均由本實驗室培養(yǎng)制備和保存。

1.2 小鼠TLR2目的基因的獲取

配制4%硫乙醇酸鹽肉湯，取3 mL腹腔注射C57BL/6小鼠，3天后處死小鼠，吸無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)輕柔沖洗腹腔，離心洗滌細胞懸液后加入培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM)，將細胞加入培養(yǎng)板培養(yǎng)1～2 h，使細胞貼壁。棄去未貼壁的細胞后，刮取貼壁細胞。Trizol法提取小鼠總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)獲得TLR2基因，引物如下：正義鏈5’-GCTCTAGAATGCTACGAGCTCTTTGGCTC-3’和反義鏈5’-ATTTGCGGCCGCCTAGGACTTTATTGCAGTTCTCAG-3’；PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s；55.6℃ 15 s；72℃ 2 min；35個循環(huán)；72℃ 5 min。配制1%瓊脂糖凝膠，并以200 mA穩(wěn)流電泳10～20 min。將觀察到的目的條帶進行割膠回收，獲得PCR擴增產(chǎn)物。

1.3 pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

用限制性內(nèi)切酶XbaI和NotI對pCDH-CMV-EF1a-GFP-puro載體質(zhì)粒和上述PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，將線性化后的載體和含有粘性末端的目的基因在連接酶的作用下，16℃連接2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，加入LB培養(yǎng)基，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45 min，然后取適量菌液涂布于LB固體平板(氨芐青霉素抗性)，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右至平板上長出單個菌落。挑取單個克隆置于5 mL LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素抗性)中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。次日集菌并根據(jù)小提質(zhì)粒試劑盒中的步驟小提質(zhì)粒，用XbaI和NotI酶切重組質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠以200 mA穩(wěn)流電泳10～20 min。將酶切鑒定構(gòu)建成功的質(zhì)粒送至擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序正確的菌液加至5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)8 h，隨后取2 mL轉(zhuǎn)移至200 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，根據(jù)大提質(zhì)粒試劑盒中的步驟大提質(zhì)粒后獲得質(zhì)粒DNA，以進行后續(xù)慢病毒包裝。

1.4 pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro慢病毒載體的包裝、濃縮

在10 cm細胞培養(yǎng)板中接種293T細胞，細胞密度達到60%～80%時，提前2 h更換新鮮培養(yǎng)基。取構(gòu)建質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒(pMD2.G和psPAX2)共10 μg(質(zhì)量比為pCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro∶pMD2.G∶psPAX2=2∶1∶1)，用500 μL Opti-MEM稀釋，充分混勻后制成DNA稀釋液。加10 μL NeofectTM于DNA稀釋液中，輕柔混勻，室溫靜置15～30 min后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物全部加入細胞培養(yǎng)基中，輕柔混勻，然后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 24 h與72 h分別在熒光顯微鏡下觀察細胞是否出現(xiàn)熒光，培養(yǎng)72 h后收集上清液。將病毒上清加到Millipore超濾管的內(nèi)管中，以4 000 r/min，4℃離心50 min，取出內(nèi)管殘留的濃縮病毒液置于-80℃冰箱保存待用。

1.5 Western blot檢測慢病毒感染293T細胞后TLR2的表達

在6孔板中接種293T細胞，細胞密度達到60%～80%時，加入102倍培養(yǎng)基體積的濃縮病毒，同時以8 μg/mL終濃度添加Polybrene。感染24 h后，吸去原培養(yǎng)基，添加新鮮培養(yǎng)基。病毒感染72 h后，收集細胞并提取蛋白。配8% SDS-PAGE分離膠、5%濃縮膠進行電泳，60 V穩(wěn)壓電泳30～40 min后將電壓調(diào)至120 V繼續(xù)穩(wěn)壓電泳1 h左右。電泳完成后以250 mA穩(wěn)流將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后配制5% BSA溶液室溫封閉1 h左右，4℃層析柜內(nèi)孵育一抗(TBST稀釋)過夜。次日用TBST洗膜(10 min×5次)，37℃恒溫雜交箱內(nèi)孵育二抗(TBST稀釋)1 h，TBST再次洗膜(10 min×5次)。洗膜完成后，將PVDF膜置于顯影儀內(nèi)，ECL顯色液進行顯色。

2 結(jié)果

2.1 小鼠TLR2目的基因的獲取

由于TLR2廣泛分布于小鼠體內(nèi)的巨噬細胞中，從小鼠腹腔中獲取巨噬細胞，提取細胞RNA后，通過RT-PCR獲得TLR2基因片段。瓊脂糖凝膠電泳觀察到擴增片段長度位于2 000～3 000 bp之間，符合預(yù)期(圖1)，提示小鼠TLR2編碼基因擴增成功。

2.2 pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

獲取TLR2基因PCR擴增片段后，用XbaI和NotI限制性內(nèi)切酶將TLR2基因片段與pCDH-CMV-EF1a-GFP-puro載體質(zhì)粒分別進行酶切，然后將TLR2基因片段插入pCDH-CMV-EF1a-GFP-puro載體質(zhì)粒中?？寺⊥瓿珊螅肵baI和NotI限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，可觀察到重組質(zhì)粒有一條約2 355 bp的條帶和一條大于5 000 bp的條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示，TLR2基因片段第873位堿基由G突變?yōu)锳，密碼子GGG突變?yōu)镚GA(圖3)，二者均編碼甘氨酸，所以是同義突變，表明克隆后的TLR2基因序列不會改變氨基酸的翻譯。因此，pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注：M：Marker；1～4：pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro重組質(zhì)粒；5～8：pCDH-CMV-EF1a-GFP-puro空載質(zhì)粒圖2 pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro重組質(zhì)粒酶切(XbaI和NotI限制性內(nèi)切酶)鑒定

注：Query：重組質(zhì)粒插入序列；Sbjct：小鼠TLR2編碼序列；紅框內(nèi)為同義突變的密碼子圖3 重組質(zhì)粒中TLR2基因序列與NCBI上小鼠TLR2序列(NM_011905.3)比對

2.3 pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro慢病毒包裝

將構(gòu)建質(zhì)粒(pCDH-CMV-TLR2-EF1a-GFP-puro)與輔助質(zhì)粒(pMD2.G和psPAX2)共同轉(zhuǎn)染293T細胞，使其包裝成完整病毒。轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下見多數(shù)細胞表達GFP綠色熒光蛋白(圖4)，說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞能表達質(zhì)粒攜帶基因編碼的蛋白。

注：A、B：未轉(zhuǎn)染細胞明視野(×100)；C、D：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的293T細胞的熒光視野(×100)；E、F：轉(zhuǎn)染TLR2重組質(zhì)粒細胞的熒光視野(×100)圖4 TLR2重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染293T細胞

2.4 Western blot驗證293T細胞中TLR2的表達

為了驗證TLR2的表達，將濃縮后的TLR2重組慢病毒以100倍的稀釋度感染293T細胞， 72 h后收集細胞進行Western blot檢測TLR2的表達。僅在陽性對照與感染TLR2重組慢病毒的細胞樣本中檢測到TLR2的表達(圖5)。因此，TLR2重組慢病毒構(gòu)建和表達成功。

注：RAW：RAW 264.7細胞(作為陽性對照)；293T：未感染的293T細胞對照；293T + Lenti-空載：293T細胞感染空載慢病毒；293T + Lenti-TLR2：293T細胞感染TLR2重組慢病毒圖5 TLR2重組慢病毒感染 293T細胞后TLR2蛋白在細胞中的表達

3 討論

TLR2作為TLRs家族中的重要一員，在病原體的識別和炎性細胞因子的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。TLR2可識別來自細菌、真菌和寄生蟲等多種微生物的病原體相關(guān)分子模式，包括存在于細菌中的脂蛋白、脂磷壁酸，結(jié)核分枝桿菌中的脂阿拉伯甘露聚糖和真菌中的幾丁質(zhì)[3,9]。此外，部分病毒也被證實能與TLR2直接相互作用，如HIV和單純皰疹病毒[10-11]。TLR2通過識別上述微生物病原體相關(guān)分子模式，從而在機體感染和免疫中發(fā)揮重要作用。

在部分病毒或細菌(如HCV)感染機體時，TLR2可與TLR1或TLR6形成異源二聚體以識別HCV核心蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3，進而介導(dǎo)巨噬細胞的激活，調(diào)節(jié)白介素-10和腫瘤壞死因子-α的分泌[12]。在結(jié)核分枝桿菌(mycobacterialtuberculosis,M.tb)感染過程中，TLR2信號通路活化引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)具有雙向性，既可介導(dǎo)殺菌作用，也能介導(dǎo)M.tb的免疫逃逸作用。如TLR2介導(dǎo)M.tb誘發(fā)的巨噬細胞早期激活，通過提升巨噬細胞的殺菌作用抑制M.tb增殖，這表明TLR2信號在M.tb感染中起防御作用[13]。然而，亦有研究表明在M.tb中鑒定出分子量19 kDa與24 kDa的兩種脂蛋白，它們能在TLR2的介導(dǎo)下，抑制巨噬細胞表面MHC Ⅱ類分子的表達，進而抑制巨噬細胞對抗原的加工，導(dǎo)致 CD4+T細胞抗M.tb的活性受阻[14-15]。關(guān)于TLR2在更多免疫細胞中的作用仍有待進一步實驗研究。

慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，來源于人類免疫缺陷病毒。慢病毒載體是一種應(yīng)用廣泛的細胞生物學(xué)工具，與其他病毒載體系統(tǒng)相比具有較多優(yōu)勢。其無論在體外還是體內(nèi)均能將遺傳物質(zhì)整合到分裂和不分裂的宿主細胞基因組中，還能在終末分化細胞如免疫細胞或神經(jīng)元中保持高效、穩(wěn)定、長期的基因表達。此外，慢病毒載體具有較大的攜帶容量，因此是十分有用的基因傳遞工具[16]。

目前，通過慢病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到成熟T細胞方面已取得豐富經(jīng)驗，如使用轉(zhuǎn)基因T細胞進行癌癥免疫治療已取得一些進展。通過將腫瘤特異性T細胞受體(T cell receptor, TCR)轉(zhuǎn)導(dǎo)到患者自身T細胞中以產(chǎn)生細胞毒性T細胞，從而殺傷腫瘤細胞。靶向B細胞標(biāo)志物CD19的CARs也可通過慢病毒載體引入T細胞，在B細胞急性淋巴母細胞白血病患者中產(chǎn)生了較好的療效[17]。目前，將基因轉(zhuǎn)移到原代B細胞中較困難，但有報道稱表面含有麻疹病毒(measles virus，MV)糖蛋白血凝素和融合蛋白的慢病毒(H/F- lvs)，能在沒有任何外源性刺激的情況下將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至完全靜止的B細胞中，且不誘導(dǎo)B細胞的激活、細胞周期的進入或表型的改變。這種慢病毒載體也能將基因高水平轉(zhuǎn)移到B細胞慢性淋巴細胞白血病細胞中，可能為改進針對腫瘤或其他疾病的疫苗接種策略或基因治療提供思路[18]。

相較于其他載體，慢病毒載體能實現(xiàn)目的基因長時間穩(wěn)定表達，不隨細胞分裂傳代而丟失，因此可用于構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的細胞株。此外，慢病毒載體轉(zhuǎn)染能力強，可有效轉(zhuǎn)染免疫細胞等終末分化細胞?；诼《据d體的以上優(yōu)點，本研究成功構(gòu)建了過表達小鼠TLR2基因的重組慢病毒，并成功在293T細胞系中表達。后期我們將進一步用TLR2重組慢病毒感染B淋巴細胞系，構(gòu)建過表達細胞系，為后續(xù)研究TLR2在B細胞中的作用提供基礎(chǔ)支撐。