應(yīng)月，于加美，朱杰，劉宇佳*

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，湖北宜昌 443000）（2.東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)健康工程與智能化加工研究中心，中國輕工業(yè)健康食品開發(fā)與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808）

魚糜蛋白質(zhì)含量豐富、脂肪含量低、容易消化，尤其具有出色的凝膠成型性，特別適用于特殊膳食用途食品中的蛋白質(zhì)類新組分[1]。魚糜作為魚類深加工的主要中間產(chǎn)品種類，容易儲(chǔ)存，方便運(yùn)輸，適合二次加工成魚糕、魚丸、魚餅、魚香腸等各類魚糜制品，具有食用方便、營養(yǎng)豐富、口感層次分明的特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[2-3]。

我國水域遼闊，魚類品種豐富，分布廣泛。在魚糜的生產(chǎn)過程中，相較于沿海地區(qū)，內(nèi)陸主要以淡水魚為加工對象。許多種類的淡水魚，特別是塘養(yǎng)的中國四大家魚（青魚、草魚、鰱魚、鳙魚），由于含有較多的細(xì)小魚骨，導(dǎo)致直接食用不便，尤其對于老年人、兒童以及具有咀嚼障礙的患者，成為阻礙特殊人群食用魚肉的主要原因[4]。因此，將淡水魚加工成為魚糜產(chǎn)品，不僅可以提高其使用方便性而且能提升產(chǎn)品價(jià)值。魚糜凝膠的制作過程一般包含鮮魚的預(yù)處理、清洗、脫水、加鹽、擂潰以及加熱成型等過程，主要成分是肌原纖維蛋白（myofibrillar protein,）、肌漿蛋白（sarcoplasmic protein）和基質(zhì)蛋白（matrix protein）[5]，其中肌原纖維蛋白在魚糜形成凝膠的過程中扮演主要角色，肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白（myosin）和肌動(dòng)蛋白（actin）組成[6]，經(jīng)過熱處理后，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變與再組裝，重新發(fā)生聚集和互聯(lián)，最終形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這些微觀結(jié)構(gòu)對于魚糜凝膠產(chǎn)品的口感、消化性以及功能性等具有重要的決定性作用[7]。原料魚的種類差異，導(dǎo)致含有的蛋白質(zhì)種類與比例都存在巨大差異，在魚糜凝膠的形成過程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（transglutaminase，TGase）能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)中γ-酰胺基和賴氨酸的ε-氨基通過酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成異型肽鍵，從而促進(jìn)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[8]，然而并不是所有魚類中都含有內(nèi)源性的TGase，這也造成了不同魚類在相同加工工藝條件下所形成的產(chǎn)品品質(zhì)具有明顯的差異[9]。

對比了8 種淡水魚魚糜凝膠的色澤、質(zhì)構(gòu)以及消化性等主要理化性質(zhì)，基于結(jié)果數(shù)據(jù)集，結(jié)合聚類分析與主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，構(gòu)建自組織映射（self-organizing maps，SOM）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，探討了原料種類對于魚糜凝膠產(chǎn)品特征的影響關(guān)系，為淡水魚魚糜產(chǎn)品的深加工提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售鮮活魚，每尾質(zhì)量在0.5～1.0 kg，經(jīng)魚類專家鑒定8 種魚的科學(xué)分類（表1）；胃蛋白酶（≥2500 units/mg），胰蛋白酶（1000～2000 units/mg）購自sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；鹽酸、氫氧化鈉，三氯乙酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 淡水魚原料種類基本信息Table 1 Basic information of freshwater fish raw materials

1.2 儀器與設(shè)備

Hunter Lab 色度計(jì)（WSC-S），上海精密科學(xué)儀器有限公司；TA.XTPlus 質(zhì)構(gòu)分析儀，英國Stable Micro Systems 公司；pH 儀，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；磁力攪拌器，上海力辰儀器科技有限公司；多功能斬拌機(jī)，浙江蘇泊爾股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚糜凝膠的制備

鮮魚→預(yù)處理→冰水清洗→去骨→去腥（冰水，3 次漂洗）→切割（5×5×5 mm3）→脫水→加鹽（3%）→擂潰（20 min）→放入腸衣（內(nèi)徑3.0 cm）并密封

樣品兩段加熱：40 ℃持續(xù)30 min，然后轉(zhuǎn)至90 ℃持續(xù)10 min。立即將加熱的樣品放入冰水中冷卻，4 ℃的冰箱中保存待分析。

1.3.2 pH 分析

將待測魚糜凝膠1.0 g 加入9 mL 去離子水，使用pH 計(jì)測量樣品pH 值。

1.3.3 顏色分析

將魚糜凝膠平鋪在測色計(jì)專用玻璃皿中，采用L*、a*和b*值用于表示樣品的顏色，并通過公式1 計(jì)算亨特白度（WH）值：

1.3.4 全質(zhì)構(gòu)分析（Texture Profile Analysis，TPA）

參照Yu 等[10]的方法，將魚糜凝膠樣品切成2.0×3.0 cm（高×直徑）的圓柱體，用于測量樣品的凝膠強(qiáng)度和TPA。凝膠強(qiáng)度測試條件：將魚糜凝膠樣品在25 ℃下平衡2 h，使用球形P/5S 探針以1 mm/s 的速度擠壓并刺入每個(gè)樣品的表面1.0 cm（原始高度的50%）。TPA測試條件：使用圓柱形P/50 探針，測前，測試速度和測后速度分別設(shè)定為2 mm/s、1 mm/s 和5 mm/s，壓縮比為50%。每次測量TPA 和凝膠強(qiáng)度至少重復(fù)9 次。

1.3.5 消化性

參照Li 等[11]的方法測定魚糜凝膠的體外模擬消化率。將樣品（5.0 g）在37.0 mL HCl 溶液（10 mmol/L）中以7500 r/min 勻漿30 s，然后加入8 mL 胃蛋白酶溶液（9 mg/mL 溶于10 mmol/L HCl）。將該混合物置于37 ℃水浴中1 h 以模擬胃消化。此后，使用1 mol/L NaOH 將pH 調(diào)節(jié)至7.5 以使胃蛋白酶失活。然后加入相應(yīng)劑量的胰蛋白酶溶液（終濃度為4%m/m，基于蛋白質(zhì)含量，pH 7.5），并在37 ℃消化2 h。將消化液樣品（1.0 mL）分別置于30、60、90、120 和180 min的2 mL 塑料離心管中。隨后終止酶促水解，并用等體積的30%三氯乙酸溶液沉淀樣品，并將混合物在4 ℃下放置過夜。將樣品在25 ℃下以10000×g 離心10 min。棄去上清液，并向試管中加入1 mL NaOH（1 mol/L）以沉淀蛋白質(zhì)。用縮二脲法測定蛋白質(zhì)濃度。體外消化率計(jì)算如下：

式中：

Ct——總蛋白質(zhì)濃度；

Cp——三氯乙酸中蛋白質(zhì)的濃度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 17.0 軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)p＜0.05 時(shí)被認(rèn)為具有顯著性差異，并用不同的字母標(biāo)記；所有數(shù)據(jù)均以含有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值方式（mean±S.D.）表示。使用SPSS 17.0 軟件中聚類分析與因子分析模塊進(jìn)行樣品聚類與PCA；使用MATLAB R2010b 軟件Artificial neural networks 模塊SOM 方法進(jìn)行自組織映射分類的數(shù)學(xué)建模。

2 結(jié)果與討論

2.1 顏色與pH

魚糜水凝膠的pH 值被認(rèn)為是與新鮮度、顏色、質(zhì)地和營養(yǎng)有關(guān)的重要質(zhì)量指標(biāo)之一。不同種類魚糜水凝膠的pH 列于表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚糜的種類差異對于pH沒有顯著性影響（p＞0.05），主要分布在6.24～6.79之間，這表明所有樣品都是新鮮的[12]，并且在相同的條件下完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

表2 不同種類魚糜水凝膠的pH 以及顏色差異Table 2 The differences of pH and color from different types of surimi hydrogels

顏色和白度是體現(xiàn)魚糜水凝膠品質(zhì)的另一個(gè)質(zhì)量指標(biāo)，直接影響消費(fèi)者對魚糜類產(chǎn)品的感官接受度。L*與魚糜凝膠的亮度有關(guān)，a*和b*值分別表示紅黃色和藍(lán)綠色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種類魚糜的顏色變化沒有表現(xiàn)出規(guī)律性，但是計(jì)算得出的WH與L*呈現(xiàn)相同的波動(dòng)規(guī)律，這表明L*可能是影響WH的主要原因。魚糜凝膠的WH通常在55～75 之間[13]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在魚糜加工工藝中，雖然由于鹽誘導(dǎo)溶解出鹽溶性蛋白，釋放出肌紅蛋白和色素，在洗滌過程中被除去[14]，從而表現(xiàn)出魚肉白皙的特點(diǎn)。但是魚的類型差異仍然是影響魚糜凝膠顏色和WH的主要因素。

2.2 質(zhì)構(gòu)分析與凝膠強(qiáng)度

TPA 用于確定魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)信息，包括硬度，膠著性，咀嚼性、黏性、彈性以及回彈性，結(jié)果如圖1 所示。這些參數(shù)定量表征了魚糜凝膠的產(chǎn)品質(zhì)量，其中硬度主要針對牙齒壓入魚糜凝膠表面的抵抗能力[15]，這對兒童，老人和某些咀嚼障礙者非常重要。從圖1a 可以看出，鱸魚魚糜凝膠的硬度最高為8566.02 N，是最低種類鰱魚的3.5 倍。膠著性和咀嚼性分別顯示半固體食品的崩解和咀嚼所需的能量[16-17]，對于所有魚糜凝膠而言，他們與硬度的變化趨勢表現(xiàn)出一致性。但是對于黏性、彈性以及回彈性指標(biāo)而言，確又表現(xiàn)出不明顯的規(guī)律。

圖1 魚糜凝膠的TPA 結(jié)果Fig.1 Texture profile analysis of surimi gel

膠凝強(qiáng)度是魚糜產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接影響到他的商業(yè)價(jià)值。通常情況下，較低的凝膠強(qiáng)度，魚糜的質(zhì)量較差并且口感較差。圖2 表明，草魚、青魚和鱸魚的凝膠強(qiáng)度最高（約1100 g·cm），且沒有顯著性差異；羅非魚魚糜的最低（446.12 g·cm），僅為最高品類的三分之一左右。魚糜樣品的凝膠強(qiáng)度主要與其再水化能力有關(guān)，較高的凝膠強(qiáng)度值表明這種蛋白凝膠具有更高的韌性和復(fù)水能力[18]，在魚糜產(chǎn)品從冷藏到再加工的過程中，展現(xiàn)出更好的品質(zhì)特性。魚糜經(jīng)過鹽洗與擂潰工藝后，鹽溶性蛋白（如肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白）充分溶解，TGase 觸發(fā)了肌球蛋白重鏈的聚合反應(yīng)，最終形成交聯(lián)的蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)，這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將更多的水分子捕獲到蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的氨基酸鏈中[7]，導(dǎo)致魚糜的質(zhì)構(gòu)發(fā)生變化，而不同種類魚的TGase 含量以及鹽溶性蛋白的所占比例差異導(dǎo)致最終魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的巨大差異[19]，這可能是導(dǎo)致不同魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的主要原因。

圖2 不同原料種類魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度Fig.2 The gel strength analysis of surimi gel form different fish

2.3 蛋白質(zhì)消化率

蛋白質(zhì)消化率可用于評估魚糜類食品蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[20]。如圖3 所示，通過計(jì)算樣品在模擬胃液和腸液中的體外消化率，對比不同種類魚糜的蛋白質(zhì)凝膠消化情況。在最初的30 min 內(nèi)，主要在模擬胃液體系中，不同種類的魚糜凝膠既表現(xiàn)出明顯的差異性，其中鱘魚的消化率最高，達(dá)到74.58%，草魚和青魚依次為67.97%和54.62%，而其它5 種魚糜凝膠在44%～48%之間（p＜0.05）。不同魚糜種類的肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白含量與比例都不盡相同，在模擬胃液中展開的氨基酸鏈結(jié)構(gòu)與數(shù)量導(dǎo)致與胃蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)也存在差異性，因此表現(xiàn)出較大的初試消化率[11]。隨后，通過將pH 調(diào)節(jié)至7.5 以使胃蛋白酶失活，使用胰蛋白酶進(jìn)行腸液的消化實(shí)驗(yàn)，各種魚糜凝膠蛋白的消化率差異逐漸減少，在消化180 min 后，消化率范圍在84.66%到96.16%之間，不同種類的魚糜蛋白質(zhì)組成以及TGase 的含量都是影響蛋白質(zhì)早期消化的重要因素[21-22]，這也導(dǎo)致了不同魚糜凝膠呈現(xiàn)出消化差異性。在經(jīng)過180 min 的模擬消化過程后最終消化率逐漸接近，除了草魚和鱘魚具有較高的消化率外，其它6 種魚糜凝膠的消化率已經(jīng)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），這表明消化過程已經(jīng)完成。

圖3 不同種類魚糜的蛋白質(zhì)消化率Fig.3 Protein digestibility of different types of surimi

2.4 聚類分析與主成分分析

為了深入研究原料種類差異與魚糜凝膠產(chǎn)品品質(zhì)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，通過數(shù)據(jù)降維的思路，以不同種類魚糜產(chǎn)品的色澤、質(zhì)構(gòu)以及消化性特征數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，使用聚類分析方法映射到一維坐標(biāo)系。圖4a 為聚類分析結(jié)果，清晰展示了不同種類魚糜凝膠的相關(guān)性，其中鯽魚、鱸魚和羅非魚聚類為一組，其它5 種魚聚類為一組，但是聚類分析主要從一維角度體現(xiàn)各研究對象的從屬關(guān)系，在闡明各個(gè)研究對象相關(guān)性層級方面則表現(xiàn)出不足，因此進(jìn)一步使用主成分分析探討他們的相關(guān)性距離。

以不同魚糜種類差異的14×8 維數(shù)據(jù)作為分析特征值，使用主成分分析方法，提取10 主成分，其中第1 主成分和第2 主成分對產(chǎn)品特征的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)99.70%，說明前2 個(gè)主成分可以有效呈現(xiàn)研究對象的特征情況。通過相關(guān)性矩陣結(jié)果（表3），展現(xiàn)了任何2 種魚糜產(chǎn)品之間的相關(guān)關(guān)系，其中數(shù)值在0.8 以上認(rèn)為是高度相關(guān)關(guān)系，0.5～0.8 是中度相關(guān)關(guān)系，0.3～0.5 是低度相關(guān)性，小于0.3 不相關(guān)。為了更為直觀的觀察到不同魚糜的相互關(guān)系，將2 個(gè)主成分映射到二維坐標(biāo)系，結(jié)果如圖4b 所示。其中，草魚與黑魚特征點(diǎn)最接近，表明這2 種魚類的產(chǎn)品在綜合特征方面更為相似；鯽魚、鱸魚以及羅非魚特征點(diǎn)都處于第一象限體現(xiàn)了他們特征的一致性，鰱魚、青魚和鱘魚特征點(diǎn)與其它點(diǎn)相對獨(dú)立，同時(shí)整體觀察到除青魚外，其它特征點(diǎn)都遠(yuǎn)離0 點(diǎn)，表明通過主成分分析方法研究對象所得到的特征性明顯，具有良好的區(qū)分度[23]。

表3 不同種類魚糜水凝膠的相關(guān)性矩陣Table 3 The correlation matrix from different types of surimi hydrogels

圖4 聚類分析與主成分分析Fig.4 Cluster analysis and principal component analysis

主成分分析是一種將高維度數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)換為低緯度統(tǒng)計(jì)量的數(shù)學(xué)方法，當(dāng)輸入數(shù)據(jù)集的特征值數(shù)量級差異較大時(shí)，則會(huì)使結(jié)果偏向于主要依靠數(shù)量級大的一組或幾組特征值，從而出現(xiàn)提取特征能力偏頗的不足，單純的使用歸一化方法又會(huì)削弱特征數(shù)據(jù)的權(quán)重[24]。食品體系是一個(gè)集合質(zhì)構(gòu)、色澤、氣味、風(fēng)味以及營養(yǎng)、功能等多維度的復(fù)雜體系，因此主成分分析方法對食品復(fù)雜體系的多種類型特征值抓取與分類具有局限性[25]，需結(jié)合其他數(shù)學(xué)方法探討他們的內(nèi)在關(guān)系。

2.5 SOM 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

本研究進(jìn)一步采用非線性無目標(biāo)自主學(xué)習(xí)的SOM 模型，通過構(gòu)建多層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，提取與分析樣本特征屬性，對其進(jìn)行自主分類，從而展現(xiàn)研究目標(biāo)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)規(guī)律。SOM 算法因其通過對特征值的主動(dòng)捕捉與自主學(xué)習(xí)，結(jié)果與特征值的初試狀態(tài)無關(guān)，能夠在多層分類后仍然保持拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，因此特別適用于具有多維度特點(diǎn)的復(fù)雜食品體系。本研究以顏色、pH、質(zhì)構(gòu)以及消化性等14×8 組特征參數(shù)為輸入層，構(gòu)建競爭層為5，輸出層為25 的自組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（圖5a），經(jīng)過train（訓(xùn)練函數(shù)）和sim（仿真函數(shù)）在輸出誤差小于收斂臨界值時(shí)完成訓(xùn)練，最終形成單一獲勝神經(jīng)元的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。圖5b 展示了不同種類魚糜凝膠經(jīng)SOM 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞诸惡蟮目臻g定位，可以發(fā)現(xiàn)草魚和黑魚主要分布在左上位置，鯽魚、鱸魚和羅非魚集中在空間的中下部分，其它3 種魚類相對獨(dú)立分布在不同位置，結(jié)果進(jìn)一步通過無規(guī)律特征數(shù)據(jù)揭示了這8 種魚糜凝膠的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。同時(shí)，圖5c 展示了各特征值對于拓?fù)浞诸惤Y(jié)果的貢獻(xiàn)，顏色越深表明該特征值對此位點(diǎn)貢獻(xiàn)越多。魚肉中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，在魚肉深加工過程中，所采取的魚肉材料種類來源是多樣的，一方面由于塘養(yǎng)淡水魚通常含有較多的細(xì)小魚骨，不便于老人、兒童等特殊人群的直接食用從而用于深加工；另一方面沿江、沿海地區(qū)捕獲的大量野生魚類，在無法快速銷售的情況下加工成魚糜制品方便于后續(xù)的儲(chǔ)藏與運(yùn)輸。使用SOM 模型研究魚糜種類與產(chǎn)品品質(zhì)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，可為魚糜制品的深加工與產(chǎn)品升級提供參考。

圖5 SOM 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型Fig.5 Self-organizing maps neural network model

3 結(jié)論

通過對比8 種淡水魚魚糜產(chǎn)品的顏色、質(zhì)構(gòu)以及蛋白消化率，結(jié)合聚類分析和PCA 方法，構(gòu)建SOM模型，探討了原料種類差異與產(chǎn)品品質(zhì)的內(nèi)在關(guān)系。結(jié)果表明，8 種魚糜凝膠的顏色具有顯著性差異，草魚、青魚以及鱸魚具有較好的凝膠成型性，其中鱸魚的膠著性、咀嚼性、彈性以及回彈性等質(zhì)構(gòu)性質(zhì)整體優(yōu)于其他種類，草魚和鱘魚魚糜凝膠由于具有較松散的結(jié)構(gòu)，具有更快的蛋白質(zhì)消化率，但最終消化率趨于一致。聚類分析與PCA 結(jié)果相互印證了不同種類魚糜的從屬關(guān)系，SOM 模型進(jìn)一步通過拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)展現(xiàn)了魚糜特征與種類之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，研究結(jié)果為我國淡水魚魚糜深加工提供了數(shù)據(jù)參考。