熊曉輝，劉若雨，張帥，林麗軍，崔曉文

（南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211899）

食源性致病菌是指食品在加工和流通過程中引入的病原菌，這些病原菌在食品中不斷生長(zhǎng)代謝導(dǎo)致食品受到污染，從而引發(fā)人類的各種疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，全球每10 人中就有1 人因攝入被污染的食物罹患食源性疾病，并且每年有42 萬人死于食源性疾病的并發(fā)癥，其中5 歲以下的兒童占40%[1]。沙門氏菌是最常見的食源性病原菌，國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（International Commission for Biological Control，ICMSF）將其健康危害等級(jí)評(píng)為嚴(yán)重危害[2]，它無芽孢和莢膜，是一種需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌。該菌對(duì)外界不利因素的抵抗能力較強(qiáng)，在7～45 ℃的條件下繁殖，存活時(shí)間較長(zhǎng)。人類一旦感染沙門氏菌，主要表現(xiàn)為以下三種形式的疾?。旱谝环N是胃腸炎，包括惡心、發(fā)熱、嘔吐與腹瀉（非傷寒沙門氏菌）；第二種主要是由傷寒沙門氏菌引起的傷寒；第三種是敗血癥，其表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、貧血和內(nèi)臟器官的局部病變[3]。我國(guó)近年來微生物性食物中毒事件的數(shù)量占所有食物中毒事件數(shù)量的50%左右，其中由沙門氏菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的70%～80%[4]。在不同類別的食品中，肉禽及其制品作為媒介引發(fā)的食物中毒事件超過90%[5]。因此，在食品工業(yè)中應(yīng)當(dāng)對(duì)肉禽及其制品中的沙門氏菌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作，以降低食源性疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（Microbiological Risk Assessment，MRA）主要包括危害識(shí)別、危害特征描述、暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)特征描述四個(gè)部分[6]。當(dāng)食品中的微生物暴露于特定條件下時(shí)，由于食品預(yù)測(cè)微生物學(xué)（Predictive Food Microbiology，PFM）可以提供微生物種群的預(yù)期變化，所以它在暴露評(píng)估過程中具有重要的作用。推動(dòng)食品預(yù)測(cè)微生物學(xué)的發(fā)展，可以合理地預(yù)測(cè)食品貨架期，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了重要依據(jù)。預(yù)測(cè)模型有很多分類方法，傳統(tǒng)上將模型分為動(dòng)力學(xué)模型和概率模型，也可以根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分為確定性模型和隨機(jī)性模型。目前大家普遍認(rèn)可的是Whiting 和Buchanan 于1993 年提出的模型分類法，即生長(zhǎng)模型和失活模型，這兩個(gè)模型又各有3 個(gè)不同層次的模型水平，分別為一級(jí)模型、二級(jí)模型和三級(jí)模型。

采取有效的殺菌技術(shù)結(jié)合預(yù)測(cè)微生物學(xué)建立沙門氏菌失活模型的研究已有報(bào)道。然而，食品工業(yè)中的沙門氏菌滅活比實(shí)驗(yàn)室水平復(fù)雜得多，不同的環(huán)境變量、食品自身理化性質(zhì)等都會(huì)影響滅活效果，尤其是在肉類的緩慢蒸煮過程中，沙門氏菌通過合成熱休克蛋白（heat shock proteins）來適應(yīng)亞致死溫度，增強(qiáng)自身耐熱性，造成持續(xù)污染。傳統(tǒng)的熱失活模型無法解釋沙門氏菌的亞致死狀態(tài)，導(dǎo)致了過高估計(jì)的致死率，這是對(duì)建模方法的一大挑戰(zhàn)。而且，雖然有大量模型可以用來描述各種失活曲線，但對(duì)于曲線上的“肩部”（“shoulder”）和“拖尾”（“tailing”）現(xiàn)象卻沒有一個(gè)滿意的統(tǒng)一解釋。此外，沙門氏菌在單細(xì)胞水平上的失活建模已成為近些年的研究熱點(diǎn)之一。其原因有兩點(diǎn)：第一，實(shí)際生產(chǎn)流通過程中的食品在經(jīng)歷多重消毒殺菌處理后，還有部分沙門氏菌以單細(xì)胞或者較低數(shù)量級(jí)的水平殘留于食品基質(zhì)中，并且在適宜條件下，這些殘留的沙門氏菌進(jìn)一步生長(zhǎng)繁殖，對(duì)食品安全造成威脅；第二，由于單細(xì)胞的行為存在極大的變異性，所以基于種群開發(fā)的確定性模型難以用于描述沙門氏菌單細(xì)胞的失活動(dòng)力學(xué)。因此，許多學(xué)者借助基于概率理論的隨機(jī)模型對(duì)沙門氏菌單細(xì)胞的失活展開研究。

綜上所述，雖然現(xiàn)階段關(guān)于沙門氏菌失活模型的研究較多，但是缺乏較為全面的概括和總結(jié)。因此，本文針對(duì)肉禽及其制品中沙門氏菌的傳統(tǒng)熱失活模型、非熱失活模型進(jìn)行闡述，并重點(diǎn)論述了亞致死狀態(tài)及單細(xì)胞水平下沙門氏菌預(yù)測(cè)建模的最新研究進(jìn)展?？蓪?duì)未來沙門氏菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供理論依據(jù)，保障食品安全及消費(fèi)者健康。

1 沙門氏菌的失活模型

借助預(yù)測(cè)微生物學(xué)可以研究不同環(huán)境條件下（溫度、pH、壓力等）沙門氏菌的失活模型，失活模型及其參數(shù)反映了不同處理?xiàng)l件對(duì)沙門氏菌的滅活程度。在食品工業(yè)中，熱處理是滅活沙門氏菌的最有效方法之一。由于過度高溫會(huì)對(duì)食品的新鮮程度及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的豐富程度產(chǎn)生不利影響，所以出現(xiàn)了一系列的非熱技術(shù)被應(yīng)用于滅活微生物。因此，下文從熱失活和非熱失活兩方面，對(duì)肉禽及其制品中沙門氏菌的失活模型進(jìn)行總結(jié)。

1.1 一級(jí)模型

一級(jí)模型是基礎(chǔ)模型，它用來描述微生物量與時(shí)間之間的函數(shù)關(guān)系。

1.1.1 熱失活

1.1.1.1 經(jīng)典線性模型

最初描述微生物失活的一階動(dòng)力學(xué)模型是由Madsen 等[7]提出的，其表達(dá)式為：

式中：

N0——初始細(xì)胞數(shù)；

N——熱處理后的細(xì)胞數(shù)；

k——一階動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

后來，Ball 等[8]用D 值表示十進(jìn)制減少時(shí)間，失活模型由Katzin 等[9]重新定義。在等溫條件下，熱失活過程由式（2）（3）的對(duì)數(shù)線性方程表示。

式中：

N0——微生物初始濃度；

N——t時(shí)間微生物濃度；

D——等溫條件下每殺死90%的原有微生物所需時(shí)間；

Z——D 值降低90%所需要升高的溫度。

對(duì)數(shù)線性模型表達(dá)微生物濃度（N）與處理時(shí)間（t）的線性關(guān)系，k 值與處理時(shí)間（t）無關(guān)。換言之，在不同的致死壓力下，種群中的所有微生物細(xì)胞均表現(xiàn)出相同的抗性，這是對(duì)數(shù)線性模型使用的前提條件。部分沙門氏菌熱失活的參數(shù)值（D 值）如表1 所示。

表1 部分食品基質(zhì)中的D 值Table 1 D value of partial food matrices

大量研究表明，式（2）、（3）中的參數(shù)D 值和Z值受到多種因素的影響，包括食品基質(zhì)、菌株類型、pH 值和抗菌劑等。首先，在肉禽及其制品中，可能含有不同數(shù)量的天然或人工添加的脂肪，脂肪含量被視為影響沙門氏菌耐熱性的主要因素之一。Gurman等[15]發(fā)現(xiàn)豬肉肉餅的脂肪含量越高，D 值越大，這與Juneja等[14]在研究脂肪含量對(duì)絞碎豬肉、牛肉、雞肉D 值影響的結(jié)果相同。由于脂肪的水分活度低、傳熱性差[16-17]，所以脂肪中的沙門氏菌能夠在更高溫度下存活更長(zhǎng)時(shí)間。但是，影響到D 值的脂肪含量可能存在數(shù)值界限，如Juneja 等[18]研究表明，當(dāng)脂肪含量低于9%時(shí)，沙門氏菌未表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性。其次，對(duì)于含有蛋白質(zhì)的食品基質(zhì)，其對(duì)沙門氏菌的緩沖保護(hù)作用不可忽略，如張佩佩等[19]在研究不同的食品基質(zhì)對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphiA）耐熱性的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)熏煮火腿中細(xì)菌失活的D 值高于營(yíng)養(yǎng)肉湯中的D 值。而且，已有研究報(bào)道，在微酸化處理的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基中病原體具有最大耐熱性，但是與普通培養(yǎng)基相比，沙門氏菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的實(shí)際食品基質(zhì)中具有更高的耐熱性。因此，在實(shí)際食品基質(zhì)中建立的失活模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性更高。另外，Gurman 等[15]、惠利娜等[20]研究了不同血清型沙門氏菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯及實(shí)際食品基質(zhì)（碎豬肉、熏煮火腿等）中的存活率差異；Wang 等[21]探究了腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）在不同pH 及NaCl 濃度的BHI 培養(yǎng)基中的存活時(shí)間差異；Ajit 等[22]、Suo 等[23]發(fā)現(xiàn)抗菌劑（酸化的亞氯酸鈉、香芹酚、肉桂醛）的添加能有效降低D 值。最后，雖然D 值、Z 值與多種因素相關(guān)，但是溫度依然是導(dǎo)致這兩個(gè)參數(shù)值發(fā)生變化的最重要因素。

由以上研究結(jié)果看出，針對(duì)肉禽及其制品而言，尤其在高脂肪含量（豬肉）、高蛋白含量（牛肉、雞胸肉等）等實(shí)際食品基質(zhì)中建立熱失活模型時(shí)，已有文獻(xiàn)中報(bào)道的D 值和Z 值只能起參考作用，確定最終參數(shù)值還需結(jié)合實(shí)際，嚴(yán)格評(píng)估實(shí)驗(yàn)條件和判斷菌株類型等。另外，雖然對(duì)數(shù)線性模型的參數(shù)受多種因素的影響，但是并不影響熱處理對(duì)沙門氏菌的滅活作用。

1.1.1.2 非線性模型

經(jīng)典的對(duì)數(shù)線性模型在世界范圍內(nèi)得到了廣泛使用，一般這種模型只有在細(xì)菌死亡速度較快的情況下才能較好地?cái)M合失活數(shù)據(jù)，然而沙門氏菌的失活并不總是遵循傳統(tǒng)的對(duì)數(shù)線性關(guān)系，D 值和Z 值無法解釋出現(xiàn)的凸型、凹型、S 型等非線性曲線問題。在大多數(shù)情況下，微生物失活的非線性曲線有以下三個(gè)特征：第一，滅活前出現(xiàn)“肩部”或“延遲（L）”現(xiàn)象；第二，處于最大失活率期（kmax），可看作對(duì)數(shù)線性階段；第三，趨向于微生物負(fù)荷的漸進(jìn)值（也可理解為“亞群（Nres）”或“拖尾”現(xiàn)象）[24]。其中，L、kmax、Nres均是一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的參數(shù)。

對(duì)于“肩部”和“拖尾”現(xiàn)象，已有許多學(xué)者作出了解釋，其中Cerf[25]解釋“拖尾”現(xiàn)象的兩大理論占據(jù)主導(dǎo)地位（如表2 所示）?！盎盍φ摚╲italistic）”認(rèn)為每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞在熱處理過程中都表現(xiàn)出相同的抗熱性，并且在特定時(shí)間死亡，所以失活曲線出現(xiàn)凸型或S 型；“機(jī)械論（mechanistic）”假設(shè)細(xì)菌在反應(yīng)中的抵抗能力與損傷程度相同，“拖尾”現(xiàn)象與觀測(cè)假相、微生物的失活機(jī)制和抵抗機(jī)制有關(guān)。這兩大理論與Stringer[26]等對(duì)非線性曲線的解釋類似。

表2 “拖尾”現(xiàn)象的解釋Table 2 The elucidation of the tailing phenomenon

目前，較多非線性模型已經(jīng)被成功地運(yùn)用到失活曲線的擬合過程中，如帶有“肩部”/“拖尾”的對(duì)數(shù)線性模型、指數(shù)模型、雙相模型等。在肉禽及其制品中，一般采用Logistic、Weibull 等概率分布模型擬合沙門氏菌的失活曲線。Suo 等[23]采用Logistic 模型擬合碎豬肉中腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）混合菌株的熱失活模型。Zhu 等[27]利用Weibull 模型建立了牛肉中混合血清型沙門氏菌的熱失活模型。Grzegorz 等[28]在研究雞肉粉中沙門氏菌的失活曲線時(shí)，對(duì)比了對(duì)數(shù)線性模型與Weibull 模型的擬合效果，由于對(duì)數(shù)線性模型無法考慮到細(xì)菌失活前的“肩部”現(xiàn)象，所以不如Weibull 模型的擬合效果好。Xiao 等[29]采用概率模型模擬雞胸肉中的沙門氏菌的失活規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)相比于指數(shù)模型和對(duì)數(shù)線性模型，Weibull 模型的擬合度最好。綜合以上分析，Weibull分布函數(shù)的應(yīng)用（式（4）、（5）均為其常見形式）更加靈活，尤其在非等溫加熱過程、復(fù)雜環(huán)境條件下的擬合效果更優(yōu)。

式中：

N0——未經(jīng)處理前樣品中沙門氏菌的菌落數(shù)，CFU/g；

Nt——經(jīng)熱處理后樣品中沙門氏菌的菌落數(shù)，CFU/g；

b或α——與數(shù)量規(guī)模相關(guān)的參數(shù)（b或α受溫度的影響，其值越大，沙門氏菌的瞬時(shí)死亡率越高）；

n或β——與分布曲線形狀相關(guān)的參數(shù)（n>1 或β>1，凸曲線；n<1 或β<1，凹曲線）。

除了Weibull 模型，雙重Weibull 模型見式（6）、（7），也可以很好地對(duì)沙門氏菌的失活數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。如Milkievicz[30]等采用該模型擬合雞肉中沙門氏菌的失活模型。建立雙重Weibull 模型基于以下假設(shè)：種群包含兩個(gè)抗性不同的亞種群，并且這兩個(gè)亞種群的失活動(dòng)力學(xué)都遵循Weibull 分布[31]。

式中：

N0——微生物初始濃度；

Nt——t時(shí)間微生物濃度；

δ1、δ2——具有不同應(yīng)激敏感性的兩個(gè)亞群出現(xiàn)第一次對(duì)數(shù)性降低的時(shí)間；

α——與數(shù)量規(guī)模有關(guān)的參數(shù)；

f——對(duì)熱處理更敏感的亞群所占比例（當(dāng)δ1<δ2時(shí)）；

n——與曲線形狀相關(guān)的參數(shù)（n>1，凸曲線；n<1，凹曲線；n=1，線性曲線）。

雖然雙重Weibull 模型具有五個(gè)參數(shù)，但是其中只有三個(gè)參數(shù)（δ1、δ2和α）與細(xì)胞的生理狀態(tài)和環(huán)境條件有關(guān)。此外，Geeraerd 等[32]開發(fā)的失活模型擬合工具GInaFiT 為使用模型提供了便利的手段。該工具涵蓋了對(duì)數(shù)線性模型、帶有“肩部”/“拖尾”+對(duì)數(shù)線性模型、Weibull 模型、Weibull+“拖尾”模型、雙相模型及雙相+肩部模型。

1.1.2 非熱失活

除了傳統(tǒng)的熱處理，近年來紫外線（UV-C）、超聲波（ultrasound）、強(qiáng)脈沖光（intense pulsed light）、超高壓（high pressure processing）等非熱技術(shù)也不斷發(fā)展。描述微生物失活的數(shù)學(xué)模型是評(píng)估食品安全性和提高質(zhì)量的有用工具。相比于經(jīng)典的對(duì)數(shù)線性模型，非線性模型及其參數(shù)能更加精確地展現(xiàn)新技術(shù)對(duì)微生物的作用效果。Mutz 等[33]采用Weibull 模型擬合短波紫外線對(duì)干制發(fā)酵香腸中鼠傷寒沙門氏菌的滅活效果。Bonah 等[34]利用超聲波技術(shù)研究了鼠傷寒沙門氏菌在豬肉中的失活情況，采用Weibull模型擬合20 kHz條件下的細(xì)菌失活數(shù)據(jù)，并且評(píng)估了模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)值β的變化。由于超聲波的空化作用造成了細(xì)菌細(xì)胞的損傷積累，所以參數(shù)值β<1。Hwang 等[35]采用雙重Weibull 模型擬合800～1800 V 脈沖強(qiáng)光變化下的腸炎沙門氏菌的失活曲線，結(jié)果表明形狀參數(shù)n 值的變化與電壓大小有關(guān)，而α值不受電壓變化的影響。但是，有研究發(fā)現(xiàn)雙重Weibull 模型的數(shù)量參數(shù)α的大小可能受到外部環(huán)境條件的影響。如Coroller 等[31]認(rèn)為α值與鼠傷寒沙門氏菌的初始細(xì)胞狀態(tài)和酸性脅迫有關(guān)。除了利用非線性模型擬合失活數(shù)據(jù)外，Lytou等[36]還基于概率方法開發(fā)了一種生長(zhǎng)/失活界面模型，該模型能用于預(yù)測(cè)經(jīng)有機(jī)酸處理后腌制雞胸肉中沙門氏菌的生長(zhǎng)和失活行為。針對(duì)食源性致病菌而言，由于食品中存在任何一部分的病原體都會(huì)為消費(fèi)者的安全埋下隱患，所以在了解致病菌失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)之上，還需要深入探究并控制致病菌的生長(zhǎng)能力。在利用不同的方法確定生長(zhǎng)/失活界面模型的界面后，不僅可以判斷致病菌的生長(zhǎng)能力，還能利用柵欄技術(shù)得到失活條件，同時(shí)估計(jì)該條件下滅活致病菌的成功概率。因此，建立界面模型對(duì)食品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)、食品安全質(zhì)量管理和食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

1.2 二級(jí)模型

二級(jí)模型是在一級(jí)模型（對(duì)數(shù)線性模型、Weibull模型等）的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析或者逐步回歸分析來預(yù)測(cè)D 值、數(shù)量參數(shù)α、形狀參數(shù)β、7 個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量減少所需的時(shí)間（ln t7.0）等[37]，如Suo 等[38]基于Logistic 模型的參數(shù)進(jìn)行二次回歸分析，從而預(yù)測(cè)ln t7.0的最佳獨(dú)立參數(shù)。針對(duì)多環(huán)境因素對(duì)沙門氏菌失活情況的影響，在表3 中對(duì)部分二級(jí)模型進(jìn)行了歸納。由于多項(xiàng)式模型能較為全面地囊括不同的環(huán)境參數(shù)及闡述其相互作用，而且適于統(tǒng)計(jì)學(xué)上多元線性回歸的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，所以得到了廣泛的應(yīng)用。但是，多項(xiàng)式模型包含許多沒有生物學(xué)意義的系數(shù)，如Roh 等[39]采用了6 個(gè)系數(shù)模擬2 個(gè)環(huán)境參數(shù)的影響。此外，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在失活模型中的應(yīng)用很少，且該模型沒有系數(shù)和參數(shù)形式。

表3 部分二級(jí)模型Table 3 Partial secondary models

綜合以上分析，經(jīng)典的對(duì)數(shù)線性模型通常適于擬合等溫條件下沙門氏菌的熱失活行為。大部分非線性模型用三個(gè)及以上的參數(shù)來表達(dá)失活曲線，由于Weibull 模型只含有兩個(gè)參數(shù)，所以被廣泛用于熱失活和非熱失活的研究中。因?yàn)榉蔷€性模型的種類眾多，所以選擇合適的模型主要依據(jù)以下兩點(diǎn)：第一，遵循簡(jiǎn)單原則；第二，借助殘差平方和（RSS）、赤池信息量準(zhǔn)則（AIC）、貝葉斯信息量（BIC）等指標(biāo)來綜合評(píng)價(jià)模型的擬合優(yōu)度，見式（8）、（9）、（10）。其中，RSS 和AIC 的值越小，模型的擬合效果越好。AIC 指標(biāo)能有效降低過擬合的可能性（若模型中的參數(shù)盡可能少），而BIC 指標(biāo)能避免出現(xiàn)模型復(fù)雜度過高現(xiàn)象。

式中：

n——數(shù)據(jù)的總數(shù)；

yi——第i小時(shí)測(cè)定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；

RSS——?dú)埐钇椒胶停?/p>

m——模型中參數(shù)的個(gè)數(shù)。

2 沙門氏菌的亞致死損傷

在肉禽及其制品的加工過程中，由于食品自身的理化性質(zhì)及柵欄技術(shù)的應(yīng)用，沙門氏菌還可能受到一定程度的亞致死損害。早在1977 年，Hurst 將亞致死狀態(tài)定義為：施加于微生物的輕微物理、化學(xué)脅迫不足以破壞及殺死微生物，致使其結(jié)構(gòu)受損、功能短暫?jiǎn)适44]。處于亞致死狀態(tài)的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一些適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)，改變自身的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理特性及基因表達(dá)，最終形成協(xié)同保護(hù)作用，從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)其它應(yīng)激條件的抵抗能力。相較于無損傷的細(xì)胞，亞致死狀態(tài)的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的成分變化更敏感。研究表明，亞致死損傷細(xì)胞在含有選擇性試劑（如氯化鈉、膽鹽、抗生素、有機(jī)酸及無機(jī)酸、脂肪酸等）的培養(yǎng)基中不能形成可見的細(xì)菌菌落，但能在營(yíng)養(yǎng)豐富的非選擇性培養(yǎng)基中恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)[45]，因此，許多研究將亞致死損傷細(xì)胞數(shù)量定義為非選擇性培養(yǎng)基與選擇性培養(yǎng)基中沙門氏菌的數(shù)量差值，見式（a）[46]。

式中：

t——處理時(shí)間；

Nnonselective(t)——t時(shí)間非選擇性培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)量；

Nselective(t)——t時(shí)間選擇性培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)量。

此外，可通過式（b）定義的時(shí)間-平均損傷細(xì)胞系數(shù)（TICC）量化亞致死細(xì)胞的數(shù)量。

式中：

t——處理時(shí)間；

tinitial到tfinal——整個(gè)處理過程的熱處理時(shí)間。

Smith 等[47]還定義了培養(yǎng)基中的恢復(fù)抑制系數(shù)（RIC），見式（c）。該系數(shù)介于負(fù)數(shù)和零之間，其值越大表明培養(yǎng)基中受損細(xì)胞的恢復(fù)能力越好。

式中：

ttotal——總處理時(shí)間。

在建立失活模型的過程中，由于使用選擇性培養(yǎng)基無法檢出亞致死損傷細(xì)胞，所以易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。在特定環(huán)境條件下，若這些亞致死損傷細(xì)胞逐步恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)，并且進(jìn)一步生長(zhǎng)、繁殖，會(huì)對(duì)食品安全構(gòu)成潛在的威脅。

沙門氏菌受到亞致死損傷的程度與多種因素相關(guān)，如血清型、生長(zhǎng)階段、培養(yǎng)基質(zhì)等。Wang 等[48]指出，經(jīng)熱處理后，肉湯中的腸炎沙門氏菌亞致死損傷率高于瓊脂中的損傷率。Suo 等[49]發(fā)現(xiàn)處于指數(shù)生長(zhǎng)期的鼠傷寒沙門氏菌更易受到熱損傷。因此，在構(gòu)建沙門氏菌死亡或亞致死損傷的預(yù)測(cè)模型時(shí)，需要考慮細(xì)胞特征、細(xì)胞密度、代謝產(chǎn)物等因素。同時(shí)，受損傷沙門氏菌的恢復(fù)能力與環(huán)境因素密切相關(guān)。Chambliss 等[50]研究發(fā)現(xiàn)，雞肉中受熱損傷的腸炎沙門氏菌群體能在TSA 培養(yǎng)基（非選擇性培養(yǎng)基）中完成自身修復(fù)，并且修復(fù)速度與培養(yǎng)溫度、酸堿度、培養(yǎng)基中氯化鈉濃度有關(guān)。溫度越高，受損傷的沙門氏菌恢復(fù)更快，但是增加酸堿度及氯化鈉濃度，會(huì)抑制沙門氏菌的熱損傷修復(fù)機(jī)制。

現(xiàn)在關(guān)于亞致死損傷的模型主要分為兩類：損傷模型和修復(fù)模型。在增加破壞力的情況下，定量評(píng)估細(xì)胞受損傷的程度，從而建立損傷模型。然而，修復(fù)模型的建立是為了預(yù)測(cè)受損細(xì)胞恢復(fù)生存能力所需的時(shí)間。如Salda?a 等[51]在應(yīng)用脈沖電場(chǎng)（pulsed electric fields，PEF）對(duì)沙門氏菌進(jìn)行滅活處理時(shí)，不僅建立了pH 及電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)沙門氏菌細(xì)胞的損傷模型，還首次將Weibull 模型用于描述選擇性培養(yǎng)基中受損沙門氏菌的生存曲線，從而量化PEF 對(duì)沙門氏菌造成的損傷程度。此外，以往研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌的耐熱性與加熱速率密切相關(guān)，因此，一些研究將溫度升高速率作為沙門氏菌失活模型的研究變量[52-53]。實(shí)際上，當(dāng)沙門氏菌在特定的溫度下，它的適應(yīng)性是隨著時(shí)間的變化而變化，并不是溫度變化速率的函數(shù)[54-55]。正如Marks 等[56]、Breslin 等[57]在開發(fā)火雞、牛肉、豬肉中混合血清型沙門氏菌的熱失活模型時(shí)，采用關(guān)于溫度、時(shí)間的積分表達(dá)式來量化細(xì)菌的亞致死細(xì)胞數(shù)量。

綜上，為了建立更加準(zhǔn)確的失活模型，在建模前不僅需要考慮到影響亞致死損傷程度、恢復(fù)程度的因素，還應(yīng)正確處理亞致死狀態(tài)與溫度、時(shí)間之間的關(guān)系。目前，關(guān)于沙門氏菌亞致死損傷程度影響因素的研究頗多，但是很少將其量化為數(shù)學(xué)表達(dá)式應(yīng)用到失活模型中，因此還需要更加深入地進(jìn)行研究。

3 沙門氏菌的單細(xì)胞失活

沙門氏菌的失活模型大多都是基于較高的初始種群（通常由數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞組成）而建立的，然而已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型中的D值只適用于大群體，當(dāng)群體細(xì)胞數(shù)量低于100 時(shí)，D 值顯示出高度可變性。再者，在食品的實(shí)際流通過程中，污染都是由較低接種量的微生物引起。在處理少量的沙門氏菌時(shí)，單細(xì)胞行為和初始細(xì)胞數(shù)量的影響被無限放大，利用確定性模型預(yù)測(cè)整個(gè)種群的失活動(dòng)力學(xué)受到了限制。因此，部分學(xué)者對(duì)單細(xì)胞的異質(zhì)性行為展開研究，這對(duì)進(jìn)一步完善沙門氏菌失活建模的工作非常必要。

關(guān)于單細(xì)胞水平上的建模大部分使用概率方法，Weibull、Gamma 等概率分布模型都將失活曲線看作是種群抗逆性失活致死的積累分布形式，這也從側(cè)面反映了失活模型都以某種方式體現(xiàn)出單細(xì)胞異質(zhì)性對(duì)群體行為可變性的影響。單細(xì)胞的異質(zhì)性行為主要通過單個(gè)細(xì)胞的失活時(shí)間來表現(xiàn)[58]。Aspridou 等[59]采用基于概率分布的Gamma 模型，見式（11），對(duì)單細(xì)胞的失活時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建模。然后，在具有不同初始細(xì)胞數(shù)量（初始細(xì)胞數(shù)量等于單細(xì)胞熱失活的次數(shù)）的條件下，利用蒙特卡洛模擬（Monte Carlo Simulation）預(yù)測(cè)細(xì)菌的失活情況。其中，模擬的次數(shù)代表了種群失活行為的可變性。模擬結(jié)果顯示，單細(xì)胞的異質(zhì)性隨著群體細(xì)胞數(shù)量的增加而被逐步掩蓋。

式中：

ti——從單細(xì)胞失活時(shí)間的概率分布中隨機(jī)選擇的時(shí)間；

N0——初始細(xì)胞數(shù)量；

Nti——ti時(shí)間的細(xì)胞數(shù)量。

此外，Koyoma 等[60]開發(fā)了一種預(yù)測(cè)模型，將泊松分布（式（12）（13））與Weibull 模型相結(jié)合，來描述沙門氏菌存活細(xì)胞數(shù)量的可變性及在單細(xì)胞水平下的存活概率。

式中：

P（X=k）——在微孔板中隨機(jī)選擇，找到k 個(gè)細(xì)胞的概率；

λ——泊松分布參數(shù)。

然而，利用失活曲線的積累數(shù)據(jù)間接估計(jì)失活時(shí)間，會(huì)導(dǎo)致描述概率分布形狀的準(zhǔn)確性降低。因此，Aspridou 等[61]開發(fā)了顯微鏡時(shí)間推移法，結(jié)合碘化丙啶（PI）熒光染色監(jiān)測(cè)單個(gè)細(xì)胞的失活行為。利用高通量細(xì)菌單細(xì)胞分析管道（BaSCA）[62]，將隨時(shí)間推移的每幀圖片轉(zhuǎn)化為對(duì)單細(xì)胞失活時(shí)間定量的依據(jù)。并且采用修正的Gompertz 方程，見式（14）擬合熒光染色細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步使用蒙特卡洛模擬預(yù)測(cè)單細(xì)胞失活時(shí)間的分布。

式中：

t——時(shí)間；

Pt——t時(shí)間細(xì)胞表面被碘化丙啶覆蓋的數(shù)量百分比；

Pmax——t→+∞時(shí)的漸進(jìn)Pt值；

μc——拐點(diǎn)切線的斜率；

λc——拐點(diǎn)切線與t軸的截距。

此外，沙門氏菌菌落的大小、菌落中細(xì)胞的位置都會(huì)影響單細(xì)胞的失活時(shí)間。目前關(guān)于沙門氏菌在單細(xì)胞水平上失活建模的研究還比較少，往后還需要進(jìn)行更深入的研究來完善失活建模工作。

4 總結(jié)與展望

在肉禽及其制品中，沙門氏菌是重點(diǎn)控制的食源性致病菌。本文總結(jié)的失活模型及其參數(shù)可以反映不同控制條件對(duì)不同食品中沙門氏菌的作用效果，這對(duì)肉禽及其制品中沙門氏菌的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及質(zhì)量控制具有重要意義。

在今后沙門氏菌的失活模型研究中，展望如下：

（1）1在實(shí)際食品基質(zhì)中建立失活模型。大多數(shù)預(yù)測(cè)模型都是基于液體模型系統(tǒng)中的實(shí)驗(yàn)而開發(fā)的，未來仍然需要基于具體情況對(duì)現(xiàn)有的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行修正甚至建立新的且更適合實(shí)際情況的模型。

（2）2研究微生物細(xì)胞恢復(fù)的機(jī)制。目前，描述細(xì)胞亞致死狀態(tài)的模型大致只有兩種，并且很少有研究涉及細(xì)胞損傷后的恢復(fù)情況。因此，模擬微生物受到細(xì)胞損傷的真實(shí)環(huán)境和研究細(xì)胞恢復(fù)的機(jī)制，能夠?yàn)榻p傷/修復(fù)模型提供理論參考。

（3）3更加深入地研究單細(xì)胞的異質(zhì)性行為。目前，雖然關(guān)于單細(xì)胞的異質(zhì)性信息非常有限，但是新開發(fā)的模型和概率方法有望得到發(fā)展和改進(jìn)。而且，進(jìn)一步研究單細(xì)胞失活時(shí)間的分布與環(huán)境之間的關(guān)系，有助于制定更加有效的食品質(zhì)量和安全管理辦法。