韓 勇，彭 程，楊 芳，王 冉，薛 雯

（1.山東省濟寧市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 濟寧 272071；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

藥用輔料的安全性和功能性指標(biāo)水平會直接影響制劑的質(zhì)量、安全和有效性。隨著輔料安全問題的日益突出，醫(yī)藥行業(yè)愈發(fā)重視藥用輔料的風(fēng)險控制［1］。2017 年，國際藥用輔料委員會發(fā)布輔料風(fēng)險評估指南［2］，要求上市許可持有人對包括輔料在內(nèi)的藥品生產(chǎn)所有物料進行風(fēng)險評估。N-亞硝基二甲胺（NDMA）屬2A 類致癌物質(zhì)［3］，也屬三大“關(guān)注隊列”的基因毒性雜質(zhì)［4］。對纈沙坦、二甲雙胍和雷尼替丁原料藥及其制劑進行專項檢查時發(fā)現(xiàn)，大部分原料藥未檢出NDMA，其制劑卻呈NDMA 陽性，針對性檢測其制劑所用10 種輔料，部分輔料被檢出NDMA。目前尚無檢測藥用輔料中NDMA 的研究［5-8］，說明藥用輔料中NDMA 未引起藥品監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)足夠重視。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS／MS）法具有靈敏度高、專屬性強等優(yōu)勢，本研究中采用該方法測定藥用輔料中NDMA 的含量，確保輔料安全性符合藥用要求?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7000D 型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；BS21S 型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；HY-4 型振蕩器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；TD16-WS 型離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；MX-S 型渦旋混勻器（大龍興創(chuàng)實驗儀器＜北京＞有限公司）。

1.2 試藥

NDMA 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為510166-201902，含量為97.8%）；二氯甲烷（農(nóng)殘級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；蒸餾水（質(zhì)譜級，美國Merck＆Co.Inc.公司）；甲醇（農(nóng)殘級，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；輔料的基本情況見表1（表中，L-HPC 為低取代羥丙基纖維素，HPMC 為羥丙甲纖維素，CMC-Na 為羧甲淀粉鈉，PVP K30 為聚維酮K30）；水為質(zhì)譜級。

表1 10 種輔料基本情況Tab.1 Basic information of 10 pharmaceutical excipients

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ThermoTG-WAMS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25 μm）；程序升溫：起始柱溫為40 ℃，保持0.5 min，以20 ℃／min 的速率升至200 ℃，再以60 ℃／min 的速率升至240 ℃，保持5 min；載氣：氦氣；流速：1.0 mL／min；進樣口溫度：250 ℃；隔墊吹掃流量：3.0 mL／min，脈沖不分流進樣，進樣壓力：12.285 psi，持續(xù)時間：0.5 min；進樣量：1.5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

碰撞氣為氬氣，離子源為電子轟擊離子源（EI），電離能量為70 eV，離子源溫度為300 ℃，質(zhì)譜傳輸線溫度為250 ℃；溶劑延遲時間為4.5 min；采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；NDMA 的母離子質(zhì)荷比（m／ z）74.1，定量離子m／ z 44.1（CE5V），定性離子m／ z 42.1（CE18V）。

2.2 溶液制備

取NDMA 對照品14.08 mg，精密稱定，加二氯甲烷溶解，即得質(zhì)量濃度為275.40 ng／mL 的對照品溶液。取輔料0.5 g，精密稱定，置25 mL 離心管中，精密加水10 mL，渦旋，振蕩，再精密加入二氯甲烷10 mL，振蕩30 min，8 000 r／min 離心10 min，取二氯甲烷層，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取HPMC陽性、陰性樣品各0.5 g，精密稱定，同供試品溶液制備方分別制備HPMC 陽性及陰性對照品溶液。以二氯甲烷為空白溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

1.NDMAA.空白對照溶液 B.對照品溶液 C.HPMC 陰性對照品溶液 D.HPMC 陽性對照品溶液圖1 總離子流圖1.NDMAA.Blank solvent B.Reference solution C.HPMC negative reference solution D.HPMC positive reference solutionFig.1 Total ion chromatograms

專屬性試驗：取2.2 項下HPMC 陽性和陰性對照品溶液、空白對照溶液（二氯甲烷）、對照品溶液各適量，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖1。結(jié)果分離度大于1.5，HPMC 陰性對照品溶液和空白對照溶液色譜中，在與對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別量取對照品溶液適量，共9 份，加二氯甲烷稀釋，即得質(zhì)量濃度分別為0.22，0.28，0.55，1.10，2.75，5.51，11.02，22.03，55.08 ng／mL 的系列對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以NDMA 質(zhì)量濃度（X，ng／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得NDMA 回歸方程Y ＝1702.6135X-6.016 6（R2＝1.000 0，n ＝9）。結(jié)果表明，NDMA 質(zhì)量濃度在0.28～55.08 ng ／ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：取2.2 項下NDMA 對照品溶液適量，加二氯甲烷稀釋，按2.1 項下試驗條件進樣測定，以信噪比（S／ N）10 ∶1 及3 ∶1 分別計算定量限和檢測限。結(jié)果檢測限為0.11ng／mL，定量限為0.28 ng／mL（RSD ＝3.76%，n ＝6）。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液適量，加二氯甲烷，搖勻。即得稀釋后的NDMA 對照品溶液（2.75mg／mL），按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果NDMA 峰面積的RSD 為1.86%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取HPMC 陽性樣品（批號為171201）溶液適量，分別于室溫下放置0，1，2，4，6，8，10 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果NDMA峰面積的RSD 為2.02%（n ＝7），表明供試品溶液在室溫下放置10 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取HPMC 陽性樣品（批號為171201）溶液適量，共6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果NDMA 峰面積的RSD 為2.52%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取HPMC 陽性樣品0.5 g（批號為171201），共9 份，置25 mL 離心管中，分別精密加入2.2 項下對照品溶液（質(zhì)量濃度為11.02 ng／mL）0.5，1.0，1.5 mL，各3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 NDMA 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test of NDMA（n ＝9）

2.4 樣品中NDMA 雜質(zhì)含量測定

取10 種輔料40 批樣品粉末（各0.5 g），分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果玉米淀粉、糊精、硬脂酸鎂、乳糖、十二烷基硫酸鈉及微晶纖維素中未檢出NDMA。HPMC，L-HPC，CMC-Na，PVP K30 的部分批次檢出NDMA，但均符合限度要求。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n ＝2，ng／mL）Tab.3 Results of content determination of NDMA in the samples（n ＝2，ng／mL）

3 討論

3.1 供試品溶液制備

按國家藥典委員會發(fā)布的《纈沙坦國家標(biāo)準(zhǔn)修訂稿》制備供試品溶液，以甲醇為溶劑會出現(xiàn)以下問題：1）精密度較差，NDMA 峰面積的RSD 為3%～5%，而以二氯甲烷為溶劑時RSD ＜2%。2）準(zhǔn)確度較差，受基質(zhì)效應(yīng)影響，高、中、低3 個質(zhì)量濃度的加樣回收率為115%～135%，測定誤差較大。以二氯甲烷為溶劑時，加樣回收率約為95%，可信度較高。3）排除輔料干擾因素，先用水渦旋、振蕩溶解樣品，加二氯甲烷振蕩萃取后，離心，取二氯甲烷層濾過，可得相對純凈的供試品溶液，可有效減少對氣質(zhì)聯(lián)用儀的污染。

為了提高檢測方法的專屬性和靈敏度，使用GC-MS／MS 時，采用脈沖不分流進樣模式提高進樣量，NDMA 峰與相鄰峰無干擾，NDMA 檢測限與定量限分別為0.22，0.28 ng／mL。該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、專屬性強，適用于相關(guān)藥用輔料的質(zhì)量控制。

3.2 關(guān)注藥用輔料中基因毒性雜質(zhì)NDMA

NDMA 毒性強，美國致癌性數(shù)據(jù)庫規(guī)定，NDMA 的半數(shù)中毒劑量（TD50）為96.0 μg／（kg·d），對于亞硝胺類雜質(zhì)用量控制應(yīng)采取“避免為主，控制為輔”的策略。經(jīng)專項檢查發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)生產(chǎn)的部分輔料確實存在微量NDMA，推斷［9-10］可能有以下幾個原因：1）工藝引入亞硝胺類雜質(zhì)，由亞硝化試劑與胺類化合物發(fā)生仲胺反應(yīng)生成。亞硝化試劑包括亞硝酸鹽、亞硝酸酯、亞硝酸、疊氮化鈉等，仲胺包括伯胺、叔胺及季銨，可能引入仲胺雜質(zhì)；酰胺類溶劑如N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等可能產(chǎn)生仲胺。2）藥用輔料生產(chǎn)過程中使用了被亞硝胺類雜質(zhì)污染的物料，包括起始物料、中間體、溶劑、試劑、催化劑等，特別是含有亞硝酸鹽或亞硝胺類的制藥用水。3）由于在同一生產(chǎn)線生產(chǎn)不同輔料，清潔不徹底，造成交叉污染。因此相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)對輔料中NDMA 的含量進行風(fēng)險評估，消除藥用輔料的安全隱患。

綜上所述，該方法操作簡便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可用于測定藥用輔料中NDMA 的含量。