張 璞

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121）

硼替佐米為首個用于治療多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶抑制劑［1］。硼替佐米作為無菌制劑的非無菌原料藥，在N，N-二甲基甲酰胺、甲醇中易溶，在水中幾乎不溶。本研究中按2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法［2］和《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（2010 年版）》［3］，對硼替佐米原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法進(jìn)行研究，為其他難溶性原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TAL-40D 型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；XPE205 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；VG3 S25 型渦旋混勻器（德國IKA 公司）；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

硼替佐米原料藥（某企業(yè)，批號分別以Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ指代）。鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號為1910283，靈敏度為0.25 EU／mL，規(guī)格為每支0.1 mL；批號為1910143，靈敏度為0.06 EU／mL，規(guī)格為每支0.1 mL。福州新北生化工業(yè)有限公司，批號為19120812，靈敏度為0.25 EU／mL，規(guī)格為每支0.1 mL；批號為19081612，靈敏度為0.125 EU／mL，規(guī)格為每支0.1 mL）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-202088，規(guī)格為每支60 EU）；Tris緩沖液（批號為2005190，規(guī)格為每支4 mL），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（BET）用水（批號為2010100，規(guī)格為每支5 mL），均購自湛江安度斯生物有限公司；福州新北生化工業(yè)有限公司（批號為19110105，規(guī)格為每支5 mL）；甲醇為色譜級。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

美國藥典論壇42（6）InProcess Revision Bortezomib制訂的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）為應(yīng)小于16 EU／mg；注射用硼替佐米成人單藥治療推薦劑量為單次1.3 mg／m2，根據(jù)2020 年版《中國藥典（四部）》規(guī)定，L ＝K ／ M ＝［5 EU／（kg·h）］／ ［1.3 mg／m2×1.62 m2÷（60 kg·h）］＝142 EU／mg，其中K 為機(jī)體每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，M 為用每千克體質(zhì)量每小時的最大供試品劑量，故原研藥將L 定為應(yīng)小于25 EU／mg。綜合考慮，將硼替佐米原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素的L 確定為16 EU／mg。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

按2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠檢查法的相關(guān)技術(shù)要求，選用標(biāo)示靈敏度為0.25，0.06 EU／mL 的鱟試劑，以BET 用水為陰性對照（NC）進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。2 個廠家4 批次鱟試劑的靈敏度實(shí)測值（λc）均在0.5 λ～2.0 λ 范圍內(nèi)，符合規(guī)定，結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab.1 Sensitivity checking results of tachypleus amebocyte lysate

2.3 干擾預(yù)試驗(yàn)

凝膠法市售鱟試劑的λ 為0.03～0.5 EU ／ mL，L 為16EU／mg，按最小有效稀釋濃度（MVD）＝λ／ L計算，得供試品有效稀釋質(zhì)量濃度為0.002 00～0.031 25 mg／mL。選取2 個不同生產(chǎn)廠家標(biāo)示靈敏度為0.25 EU／mL 的鱟試劑進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)。取3 批樣品，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為12.5 mg ／mL 的供試品溶液，用Tris 緩沖液稀釋至3.125 mg ／mL，再加BET 用水稀釋，分別制得質(zhì)量濃度為0.031 25，0.015 62，0.007 80，0.003 90，0.002 00 mg／mL 的系列陰性對照（NPC）溶液；同法操作配制一組含2 λ 細(xì)菌內(nèi)毒素的系列陽性對照（PPC）溶液；以含2 λ 即0.50 EU／mL 的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液為陽性對照（PC），以BET 用水為陰性對照（NC）。各平行制作2管，每管加樣后混勻，在（37±1）℃的試管恒溫儀中保溫（60±2）min。試驗(yàn)結(jié)果見表2。據(jù)此初步判斷，供試品溶液質(zhì)量濃度在0.003 90 mg／mL 時對不同廠家的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾。

表2 硼替佐米干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The pre-interference test results of bortezomib

2.4 正式干擾試驗(yàn)

根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，取樣品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為12.5 mg／mL 的供試品溶液，再依次用Tris 緩沖液、BET 用水稀釋，得質(zhì)量濃度為0.003 9 mg／mL 的溶液A。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET 用水稀釋至0.125，0.060，0.030，0.015 EU／mL，即得內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液；用溶液A 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.125，0.060，0.030，0.015 EU／mL，作為供試品A；每個濃度均平行4 管。以BET 用水作NC，平行2 管。通過試驗(yàn)結(jié)果計算出細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液的內(nèi)毒素反應(yīng)終點(diǎn)濃度（Es）和供試品A 內(nèi)毒素反應(yīng)終點(diǎn)濃度（Et）。結(jié)果見表3?？梢姡珽s及Et均在0.5 λ～2.0 λ范圍內(nèi)，表明供試品溶液質(zhì)量濃度為0.003 9 mg／mL時，對2 個廠家的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均無明顯干擾。

表3 硼替佐米正式干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The interference test results of bortezomib

2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3 批次樣品各適量，按2.2 項(xiàng)下0.003 90 mg／mL NPC 溶液的試驗(yàn)方法，同時按藥典要求設(shè)立PPC 管、NC管和PC 管。取2 個廠家靈敏度為0.06 EU／mL 的鱟試劑進(jìn)行檢查。結(jié)果見表4。可見，3 批次樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量均符合規(guī)定。

表4 硼替佐米細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.4 The bacterial endotoxin test results of bortezomib

3 討論

鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)需在水溶液中進(jìn)行，難溶性藥物可根據(jù)自身的溶解性選擇合適的溶劑如二甲基亞砜（DMSO）、乙醇、二氯甲烷等［4-7］進(jìn)行溶解，然后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。硼替佐米在水中幾乎不溶［8］，且高濃度的硼替佐米溶液對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)有干擾［9］。前期研究顯示，3 批樣品的pH 約為5.4。故首先根據(jù)硼替佐米的溶解性選擇甲醇溶解，再用Tris 緩沖液調(diào)節(jié)pH，最后經(jīng)BET 用水稀釋得檢查用溶液。經(jīng)上述方法稀釋后，能完全消除各種干擾因素對樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的影響，且方法的靈敏度高、可靠性強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)硼替佐米原料藥的L 確定為16 EU／mg，質(zhì)量濃度稀釋至0.003 90 mg／mL，選用靈敏度不低于0.06 EU／mL 的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)時，對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無明顯干擾。

綜上所述，本研究中建立的方法可用于硼替佐米的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。