張煜帆，余潔真，池浩波，陸湘樺，佘溢彬

（廣東省潮州市藥品檢驗(yàn)所，廣東 潮州 521000）

腸瘍消丸為潮州市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由黃芪、黃連、金銀花等16 味中藥組方，主要功效為疏肝健脾、理氣止痛、利濕止瀉、收斂生肌，治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎等的療效顯著。其原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草時(shí)間早，尚未建立有效成分的含量測定方法，質(zhì)量控制缺少重要依據(jù)，有必要加以改進(jìn)。黃芪和金銀花作為方劑中的君藥和臣藥，其活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸具有一定抗炎作用［1-2］。毛蕊異黃酮葡萄糖苷屬黃酮類化合物，有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用［3-4］，可抑制潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠大腸組織中炎性因子mRNA 的表達(dá)及炎性因子水平的升高，對潰瘍性結(jié)腸炎療效明確［5-6］。綠原酸為金銀花的主要活性成分，有抗菌、抗氧化、強(qiáng)化機(jī)體免疫功能等作用［7-8］，能較好地緩解三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的腸黏膜損傷，保護(hù)腸道的屏障作用［9］。腸瘍消丸的成分繁多，普通高效液相色譜（HPLC）法對復(fù)雜樣品多組分的分離有局限性，極性相似的組分易相互干擾，不易分離，影響定性定量的準(zhǔn)確性。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS／MS）法通過對母離子和子離子的質(zhì)量篩選，能很好地對目標(biāo)組分進(jìn)行定性和定量分析，可獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果［10-11］。本研究中建立了同時(shí)測定腸瘍消丸中綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的UHPLC-MS／MS 法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Triple Quad 3500 型三重四極桿超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）；XS205DU 型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Fotector-04HT 型固相萃取儀（?？苾x器有限公司）；PS-80A 型超聲波清洗器（東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

腸瘍消丸（潮州市中醫(yī)院，批號分別為20180612，20181209，20190325）；綠原酸對照品（批號為110753-201716，含量為99.3%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920-201907，含量為96.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：ThermosHypersilGOLD色譜柱（150mm×3mm，3 μm）；固相萃取小柱［Waters Oasis HLB 3cc（60 mg）］；流動(dòng)相：0.3% 甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min 時(shí)5%B，3～7 min 時(shí)100%B，7～9 min 時(shí)5%B）；流速：0.2 mL／min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測模式的參數(shù)見表1；正離子掃描；離子源電壓：4 500 V；霧化器溫度：500 ℃；氣簾氣：40 psi；碰撞氣：9 psi；噴霧氣30 psi；輔助加熱氣：20 psi。

表1 主要成分多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Tab.1 MRM parameters of main components

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率480 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，12 500 r／min 離心15 min，取上清液，即得供試品溶液（純化前）。精密量取20 mL，經(jīng)自動(dòng)固相萃取儀（主要參數(shù)見表2），用HLB 固相萃取小柱純化收集，濃縮并定容至5 mL；即得供試品溶液（純化后）。

1，3.綠原酸 2，4.毛蕊異黃酮葡萄糖苷A.一級質(zhì)譜 B.二級質(zhì)譜圖1 對照品多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖1，3.chlorogenic acid 2，4.calycosin-7 -glucosideA.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometryFig.1 MRM chromatograms of reference substance

表2 固相萃取儀主要參數(shù)Tab.2 Main parameters of solid phase extractor

對照品溶液：取綠原酸對照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為120.8 μg／mL 的對照品貯備液A。取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為2.570 μg／mL 的對照品貯備液B。各精密量取適量置容量瓶中，用甲醇稀釋，得綠原酸質(zhì)量濃度為1.208，2.416，4.832，12.080，24.160，60.400 μg／mL，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為0.025 7，0.051 4，0.102 8，0.257 0，0.513 9，1.285 0 μg／mL 的混合對照品溶液（記為S1，S2，S3，S4，S5，S6）。

空白對照溶液：以甲醇作為空白對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

A.空白對照溶液 B.混合對照品溶液 C.供試品溶液（純化前）D.供試品溶液（純化后）圖2 UHPLC-MS／MS 圖A.Blank reference solution B.Mixed reference solution C.Test solution（before purification）D.Test solution（after purification）Fig 2 UHPLC-MS／MS chromatograms

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液（純化前、純化后）、空白對照溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣，記錄信號強(qiáng)度（見圖2）。結(jié)果顯示，供試品溶液與混合對照品溶液在相同時(shí)間處有相應(yīng)峰，陰性對照無干擾，且純化后的供試品溶液雜質(zhì)顯著減少。

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，以綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 各組分線性關(guān)系考察結(jié)果（n ＝5）Tab.3 Results of the linear relation test of each component（n ＝5）

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液S4，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸信號強(qiáng)度。結(jié)果的 RSD 分別為1.91%，2.79%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品粉末（批號為20180612）適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸信號強(qiáng)度。結(jié)果的RSD 分別小于1.80%和2.30%（n ＝7），表明室溫下供試品溶液放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號20180612）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄信號強(qiáng)度并計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸含量。結(jié)果的RSD 分別為3.48% 和2.89%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（20190325）樣品約6 g（1 次服用量），粉碎，平行稱取藥品粉末6 份，精密稱定，分別加入2.2 項(xiàng)下對照品貯備液A 和對照品貯備液B 各1 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄信號強(qiáng)度，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.4 Results of the recovery test（n ＝6）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣2 次，記錄信號強(qiáng)度，并計(jì)算綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品中綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定結(jié)果（μg／g，n ＝2）Tab.5 Results of content determination of chlorogenic acid and calycosin-7 -glucoside in the sample（μg／g，n ＝2）

3 討論

3.1 檢測方法

毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸均易溶于甲醇，故以甲醇作為溶劑有助于提高目標(biāo)成分的提取率。上述成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)均存在共軛雙鍵，對紫外光譜有一定吸收，預(yù)試驗(yàn)中曾選擇HPLC 法進(jìn)行測定［12-14］。腸瘍消丸的處方中含有十幾味藥材，用甲醇提取的供試液成分較復(fù)雜，通過SPE 小柱萃取能有效減少供試品中的雜質(zhì)。但由于紫外檢測器選擇性不高，各成分的色譜峰互相干擾嚴(yán)重，無法有效對目標(biāo)成分進(jìn)行分離。故本方法采用選擇性高的UHPLC-MS／MS 法，通過對母離子和子離子的篩選，建立離子對，同時(shí)對2 個(gè)目標(biāo)成分進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量分析。

3.2 測試條件

有文獻(xiàn)報(bào)道，測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量時(shí)正負(fù)離子模式可能與不同品牌的儀器有關(guān)［15-16］。預(yù)試驗(yàn)中分別嘗試正負(fù)2 種模式對目標(biāo)成分的測量條件進(jìn)行優(yōu)化，在負(fù)離子模式下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的響應(yīng)較正離子模式弱。選擇［M+H］+的正離子模式時(shí)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的母離子和子離子均有較好的響應(yīng)值，靈敏度較高，專屬性強(qiáng)，雜質(zhì)干擾小，對色譜柱的分離要求相對較低，故選擇正離子掃描模式。

3.3 方法評價(jià)

本研究中成功建立了UHPLC-MS／MS 法同時(shí)測定腸瘍消丸中的綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，其操作方法簡便、快捷，分析時(shí)間短，分離效果好，靈敏度高，有利于控制和分析制劑質(zhì)量。