胡獻躍，黃東緯，陳笑笑，刁銀軍

（金華職業(yè)技術學院，浙江 金華 321016）

歷代本草將續(xù)斷列為強筋骨、續(xù)折傷良藥，其有效成分續(xù)斷皂苷可誘導大鼠骨髓間充質干細胞（BMSC）向成骨細胞分化和礦化［1］，促進骨形成蛋白2（BMP-2）表達的同時，明顯增高其下游關鍵磷酸化蛋白SMAD1／5／8，P38，ERK1／2 的表達量［2］，還可明顯上調成骨細胞護骨因子（OPG）／核因子-κB（NF-κB）受體激活蛋白配體（RANKL）的表達，通過調節(jié)成骨細胞的分泌因子而調節(jié)破骨細胞的活化［3］，廣泛用于治療骨質疏松癥。續(xù)斷提取工藝的不同會影響提取物的質量和藥效，本研究中采用高氯酸顯色法、液相色譜-質譜（LC-MS）法和體外釋放法測定，評價了續(xù)斷離子液體提取物與上市對照藥材間的質量差異；通過MC3T3-E1 細胞生長和堿性磷酸酶（ALP）活力測定，評價了續(xù)斷離子液體提取物對成骨細胞的作用；通過測定對破骨細胞RAW264.7 生長和抗酒石酸酸性磷酸酶（StrACP）活力的抑制作用，評價了續(xù)斷離子液體提取物對破骨細胞的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與細胞

1.1 儀器

KQ-500DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LC-MS8045 型液質聯(lián)用儀（日本島津公司），配有UV2600 型紫外分光光度計；3111 型CO2水套培養(yǎng)箱（美國熱電公司）；Micro Beta 2450 型液體閃爍計數(shù)儀，D961962 型細胞收集儀（Perkin Elmer 公司），細胞收集器為FilterMate Harvester；HR40-Ⅱ-A2 型醫(yī)用凈化工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；5810R 型低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；BS210S 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為0.1 mg）；CK40-F200 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；YXQ-208SD 型電熱蒸汽滅菌器（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）；RCZ-6C3 型智能溶出儀（天津天大公司）。

1.2 試藥

離子液體提取物（自制，批號分別為20200630，20200702，20200705，分別含川續(xù)斷皂苷Ⅵ68.43%，69.21%，68.72%）；續(xù)斷壯骨膠囊（浙江迪耳藥業(yè)有限公司，批號為20191004，每粒含續(xù)斷皂苷提取物0.28 g）；α-MEM 培養(yǎng)液（批號為2005060303），磷酸鹽緩沖液（PBS，批號為2005080101），0.25%胰蛋白酶（批號為2004240202），均購自浙江森瑞生物科技有限公司；超級胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號為19110501）；二甲基亞砜（DMSO，成都市科龍化工試劑廠，分析純）；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR，中國同輻股份有限公司，產品編號為NET027L，批號為201807，濃度為1 mci／mL，活度為37 Mbq）；ALP 測試盒（貨號為A059-1-1，批號為20200724），StrACP 測試盒（貨號為A058-1-1，批號為20200803），均購自南京建成生物工程研究所；小鼠重組可溶性NF-κB 受體活化因子配體（sRANKL，美國Peprotech 公司，貨號為315-11C，批號為0815612-A2518）；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［Emim］BF4，中科院蘭州化學物理研究所，批號為CP0082216，含量≥99%），異綠原酸A 對照品（批號為DST190918-036），異綠原酸B對照品（批號為DST191008-037），異綠原酸C對照品（批號為DST190904-038），馬錢苷酸對照品（批號為DST191025-033），綠原酸對照品（批號為DST190906），咖啡酸對照品（批號為DST191030-013），馬錢苷對照品（批號為DST200628-038），川續(xù)斷皂苷乙對照品（批號為DST191202-56），川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號為DST191126-041），均購自成都德思特生物技術有限公司，含量均高于98.0%。

1.3 細胞

小鼠單核細胞RAW264.7 細胞株（破骨細胞），MC3T3-E1 細胞株（成骨細胞），均由中國科學院干細胞庫提供。

2 方法與結果

2.1 續(xù)斷總皂苷提取物制備

取續(xù)斷藥材100 g，粉碎，過10 目篩，加入0.90 mol／L的［Emim］BF41 000 mL，超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz，下同）提取60 min，濾過，取提取液，置旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至200 mL，加入大孔樹脂柱中，用1 個柱體積的水洗至近無色，用3 個柱體積的20%乙醇洗至淡黃色，用60%乙醇洗至近無色，60%乙醇洗脫液旋轉蒸發(fā)（80 ℃，-0.08 MPa）近干，刮下沉淀物，真空干燥（60 ℃，-0.08 MPa），得續(xù)斷總皂苷提取物［4-5］。

2.2 續(xù)斷總皂苷提取物質量分析

2.2.1 續(xù)斷總皂苷含量測定

線性關系考察：取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.5 mg／mL 的溶液。精密量取上述溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，于65 ℃水浴氮氣流吹干甲醇，精密加入高氯酸5 mL，渦旋混合1 min，65 ℃水浴加熱20 min，冰浴放冷。于406 nm 波長處測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標、溶液質量濃度（X，mg／mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝9.015X+0.0035（r ＝0.999 1，n ＝5）。結果表明，續(xù)斷總皂苷質量濃度在0.02～0.10 mg／mL 范圍內與吸光度線性關系良好。

含量測定：取樣品0.1 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇稀釋并定容，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液3 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，精密量0.4 mL，置10 mL具塞試管中，按線性關系考察項下方法處理，計算總皂苷的含量。結果見表1。

表1 樣品中總皂苷含量和川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶出率測定結果（%）Tab.1 The content of total saponins and the dissolution rate of asperosaponin Ⅵin the samples（%）

可見，續(xù)斷離子液體提取物中總皂苷含量高于續(xù)斷壯骨膠囊，這可能是由于大孔樹脂柱層析不僅除去了離子液體成分，還利用了各成分的極性差異，將多糖等在水和低濃度乙醇中溶解度較高的成分先行洗脫，而皂苷類成分主要集中于60 %乙醇洗脫液中，從而使皂苷類成分得到純化。

2.2.2 體外溶出度測定

漏槽試驗：取續(xù)斷壯骨膠囊2 粒，置50 mL 容量瓶中，加水適量，超聲30 min，溶解，定容，濾過，測得漏槽中溶劑的質量濃度為0.226 mg／mL。

體外溶出度試驗：取樣品，照漿法測定體外溶出度。以1 000 mL 水為溶出介質，100 r／min 旋轉60 min，取溶液10 mL，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品20 mg，加20 %甲醇溶解，定容至100 mL，即得質量濃度為0.2 mg／mL 的對照品溶液。于215 nm 波長處測定吸光度，按外標法計算含量。結果見表1。可見，續(xù)斷壯骨膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的溶出率低于續(xù)斷離子液體提取樣品，這是因為其多糖成分含量較高，在水中迅速糊化，抑制水進一步滲透，使川續(xù)斷皂苷Ⅵ不能釋放，造成溶出率較低。

2.2.3 樣品中9 種成分含量測定

色譜條件：島津C18柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相：流動相A 為乙腈-甲醇溶液（6 ∶4，V／ V），流動相B 為0.2%甲酸-水溶液（梯度洗脫程序見表2）；流速：0.4 mL／min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Gradient elution program of mobile phase（%）

質譜條件：電噴霧離子源，負離子模式，多反應監(jiān)測（MRM），霧化氣、干燥氣、加熱氣均為高純氮，流量分別為3，10，10L／min；接口溫度：300℃；加熱塊溫度：400℃。通過一級質譜全掃描確定前體離子，根據(jù)前體離子進行二級質譜碎裂，確定相應的定性和定量離子，建立離子對，創(chuàng)建MRM 方法。離子對選擇及碰撞電壓條件參數(shù)見表3。

表3 質譜條件參數(shù)Tab.3 Parameters of mass spectrum conditions

線性關系考察：分別取異綠原酸A，B，C 及馬錢苷酸、咖啡酸、馬錢苷、綠原酸、川續(xù)斷皂苷乙、川續(xù)斷皂苷Ⅵ9 種對照品各適量，用20% 甲醇配制成質量濃度為0.1 mg／mL 的對照品貯備液。分別取上述對照品貯備溶液各適量，加入20%甲醇稀釋成質量濃度為0.5，1.0，2.0，4.0，6.0μg／mL 的各適量系列單一對照品溶液，按上述色譜／質譜條件進樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標、對照品溶液質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標進行線性回歸。結果見表4。表明各對照品溶液質量濃度在0.5～6.0 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

表4 線性關系考察結果（n ＝5）Tab.4 Results of the linear relation test（n ＝5）

樣品含量測定：取續(xù)斷離子液體提取物（批號為20200630）和續(xù)斷壯骨膠囊（批號為20191004）各20 mg，精密稱定，加20%甲醇適量，置100 mL 容量瓶中，超聲溶解，加20 %甲醇定容，取1 mL，用20%甲醇稀釋至50 mL，按色譜／質譜條件進樣測定。結果見表5?？梢姡m(xù)斷離子液體提取物中有效成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ較續(xù)斷壯骨膠囊高13.83%。

表5 樣品中9 種成分含量測定結果（mg／g）Tab.5 Results of content determination of nine components in the sample（mg／g）

2.3 藥效學試驗

對MC3T3-E1 及RAW264.7 細胞生長的影響：取對數(shù)生長期小鼠單核細胞RAW264.7 細胞株及MC3T3-E1 細胞株，分別制成5×104mL-1單細胞懸液，分別取100 μL 加入96 孔平底培養(yǎng)板中，37 ℃及5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后分別加入含不同質量濃度的續(xù)斷離子液體提取物／續(xù)斷壯骨膠囊（1.56～200.00 μg／mL）培養(yǎng)液100 μL，每個濃度做3 個復孔，空白對照組加入相同體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后分別加入含0.3 μci3H-TdR 的培養(yǎng)液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，收集細胞，測定每個樣品的脈沖數(shù)，用三孔的平均脈沖數(shù)評估各濃度樣品對破骨細胞RAW264.7 及成骨細胞MC3T3-E1 生長的影響。結果見表6 和表7。與空白對照組（0 μg／mL）比較，質量濃度為6.25～100.00 μg／mL 的續(xù)斷離子液體提取物可顯著促進MC3T3-E1 細胞生長，且呈量效依賴關系（P ＜0.05），但高濃度（200 μg／mL）時促進作用不明顯，提示高濃度的續(xù)斷皂苷可能存在一定細胞毒性作用。顯微鏡下可見MC3T3-E1 細胞呈多角形，貼壁生長，幾乎無脫落，胞質飽滿，相鄰細胞生長融合成片，藥物作用后的細胞數(shù)量明顯多于空白對照組，且續(xù)斷離子液體提取物的作用明顯優(yōu)于續(xù)斷壯骨膠囊。由表7 和圖2 可見，與空白對照組（0 μg ／ mL）比較，質量濃度為12.50～200.00 μg ／ mL 的續(xù)斷離子液體提取物可顯著抑制RAW264.7 細胞生長，且呈量效依賴關系（P ＜0.05）。顯微鏡下可見RAW264.7 細胞呈多變形，貼壁生長，部分細胞脫落，藥物作用后的細胞數(shù)明顯少于空白對照組，且續(xù)斷離子液體提取物對RAW264.7細胞的抑制作用優(yōu)于續(xù)斷壯骨膠囊。

表6 續(xù)斷皂苷對成骨細胞MC3T3 -E1 生長的影響（± s，cpm，n ＝3）Tab.6 Effect of asperosaponin Ⅵon the growth of osteroblasts MC3T3 -E1 cells（± s，cpm，n ＝3）

表6 續(xù)斷皂苷對成骨細胞MC3T3 -E1 生長的影響（± s，cpm，n ＝3）Tab.6 Effect of asperosaponin Ⅵon the growth of osteroblasts MC3T3 -E1 cells（± s，cpm，n ＝3）

注：與0 μg／mL 比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。表7 至表9 同。Note：Compared with 0 μg／mL，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001，as well as Tab.7 to Tab.9.

表7 續(xù)斷皂苷對破骨細胞RAW264.7 生長的影響（± s，cpm，n ＝3）Tab.7 Effect of asperosaponin Ⅵon the growth of osteoclasts RAW264.7 cells（± s，cpm，n ＝3）

表7 續(xù)斷皂苷對破骨細胞RAW264.7 生長的影響（± s，cpm，n ＝3）Tab.7 Effect of asperosaponin Ⅵon the growth of osteoclasts RAW264.7 cells（± s，cpm，n ＝3）

對成骨細胞MC3T3-E1 ALP 活性的影響：取對數(shù)生長期的成骨細胞MC3T3-E1 細胞株，胰酶消化后吹打成單個細胞懸液，配成濃度為5×104mL-1的細胞，接種于24 孔板中，每孔1 mL，設2 個復孔，置37 ℃及5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分別加入含不同質量濃度的續(xù)斷離子液體提取物／續(xù)斷壯骨膠囊培養(yǎng)液（6.25～200.00 μg／mL），置37 ℃及5 %CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸去上清液，PBS 洗滌2 次，每孔加入400 μL 0.1% Triton X-100 以裂解細胞，冰浴10 min。取上清液，用BCA 試劑盒測定裂解液中的蛋白質濃度，按試劑盒操作方法測定ALP 的活性。結果見表8?？梢?，與空白對照組比較，不同質量濃度的續(xù)斷離子液體提取物及續(xù)斷壯骨膠囊均可提高MC3T3-E1 細胞ALP 的活性，但差異不顯著（P ＞0.05）。

表8 續(xù)斷皂苷對成骨細胞MC3T3 -E1 ALP 的影響（± s，U／gprot，n ＝3）Tab.8 Effect of asperosaponin Ⅵon the activity of ALP in osteoblast MC3T3 -E1 cells（± s，U／gprot，n ＝3）

表8 續(xù)斷皂苷對成骨細胞MC3T3 -E1 ALP 的影響（± s，U／gprot，n ＝3）Tab.8 Effect of asperosaponin Ⅵon the activity of ALP in osteoblast MC3T3 -E1 cells（± s，U／gprot，n ＝3）

對破骨細胞RAW264.7 StrACP 活性的影響：取對數(shù)生長期的破骨細胞RAW264.7 細胞株，胰酶消化后吹打成單個細胞懸液，制成5×104mL-1細胞懸液，接種于24 孔板中，每孔1 mL，設2 個復孔，置37 ℃及5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，RANKL 對照組每孔加入50 μL無血清培養(yǎng)基配制的RANKL 和100 μL 無血清培養(yǎng)基，試驗組每孔加入以無血清培養(yǎng)基配制的RANKL 50 μL和不同濃度的續(xù)斷離子液體提取物／ 續(xù)斷壯骨膠囊（終濃度6.25～200.00 μg／mL），RANKL 的終濃度為100 ng／mL。置37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48h，吸去上清液，PBS 洗滌2 次，每孔加入400μL1%TritonX-100 以裂解細胞，冰浴10 min。取上清液，用BCA 試劑盒測定裂解液中的蛋白質濃度，按StrACP 試劑盒操作方法測定StrACP 的活性。結果見表9?？梢?，與0 μg／mL比較，質量濃度為12.5～200.0 μg／mL 的續(xù)斷離子液體提取物可顯著抑制RAW264.7 細胞StrACP 酶的活性（P ＜0.05）。

表9 續(xù)斷皂苷對破骨細胞RAW264.7 StrACP 活性的影響（± s，U／gprot，n ＝3）Tab.9 Effect of asperosaponin Ⅵon the activity of StrACP in osteoclasts RAW264.7 cells（± s，U／gprot，n ＝3）

表9 續(xù)斷皂苷對破骨細胞RAW264.7 StrACP 活性的影響（± s，U／gprot，n ＝3）Tab.9 Effect of asperosaponin Ⅵon the activity of StrACP in osteoclasts RAW264.7 cells（± s，U／gprot，n ＝3）

3 討論

骨質疏松癥的發(fā)病機制為成骨細胞和破骨細胞失衡，造成骨的形成低于骨的吸收［6-7］。續(xù)斷提取物中主要成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ可通過促進BMP-2 的生成，調節(jié)c-Jun 的磷酸化，激活c-Jun 氨基端激酶（JNK）信號通路，誘導BMSC 向成骨細胞分化，增加骨形成和生長，發(fā)揮治療骨質疏松的作用［8］。且川續(xù)斷皂苷Ⅵ能提高β 聯(lián)蛋白（β-catenin）、Runx2 及骨鈣素的表達，從而激活Wnt ／ β -catenin 信號通路，進而促進BMSC 的成骨分化［9］。因此，續(xù)斷提取物可通過多種細胞通路促進成骨細胞的分化與增殖，發(fā)揮治療骨質疏松的作用，但其對破骨細胞的抑制作用仍有待進一步研究［10］。

由表1 可知，續(xù)斷離子液體提取物中總皂苷含量較續(xù)斷壯骨膠囊高9.23%，川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶出率高203.90%，提示續(xù)斷離子液體提取物較續(xù)斷壯骨膠囊藥效更強。由表6 至表9 可知，與空白對照組比較，續(xù)斷離子液體提取物和續(xù)斷壯骨膠囊質量濃度均在25～100 μg／mL 范圍內可顯著促進MC3T3-E1 細胞生長（P ＜0.01）；當續(xù)斷離子液體提取物的質量濃度為200 μg／mL 時，對MC3T3-E1 細胞的增殖作用反而不明顯，預示存在一定的細胞毒性作用，臨床使用時應注意給藥劑量。但2 種提取物對MC3T3-E1 細胞ALP 活性的影響均不顯著（P ＞0.05），這可能是由于ALP 是成骨細胞早期分化的標志物［1］，而本研究中成骨細胞處于生長階段，故指標變化不顯著；2 種提取物質量濃度大于12.5 μg／mL時均可顯著抑制RAW264.7 細胞生長，同時還抑制了骨吸收的標志性指標StrACP 的表達［11］，提示2 種提取物均有抑制破骨細胞生長的作用。

綜上所述，續(xù)斷離子液體提取物質量優(yōu)于續(xù)斷壯骨膠囊，具有促進破骨細胞RAW264.7 生長和抑制成骨細胞MC3T3-E1 活性的雙向作用。