夏立君，張彥波

（河北省衡水市中醫(yī)醫(yī)院，河北 衡水 053000）

銀屑病是以紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)為主要特征的常見慢性炎性皮膚病，發(fā)病率高，病程長(zhǎng)，且呈周期性反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于該病尚無特效治療方法，西醫(yī)內(nèi)服、外用藥及物理療法均有一定不良反應(yīng)，且停藥后易復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)期療效較差［2］。中藥復(fù)方治療本病副作用小，且能有效降低復(fù)發(fā)率，縮短病程［3］。祛風(fēng)地黃湯對(duì)治療尋常型銀屑病療效良好，但其作用機(jī)制的研究尚未見報(bào)道［4］。銀屑病發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌、免疫異常等多種因素，其中輔助性T 細(xì)胞17（Th17）／調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）平衡失調(diào)引起的免疫功能異常為重要原因［5］。本研究中以咪喹莫特復(fù)制銀屑病小鼠模型，以祛風(fēng)地黃湯灌胃，觀察對(duì)小鼠皮損的改善作用，并探討其通過調(diào)節(jié)Th17／Treg 細(xì)胞免疫平衡而發(fā)揮作用的可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：EG1160 型石蠟包埋機(jī)、2135 型組織切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；CX23 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；GENion Plus 型功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；Mirofuge 20 R 型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；165-8001 型凝膠電泳儀、1652100 型電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

藥品、試劑、飲片：甲氨蝶呤片（上海上藥信誼藥廠，批號(hào)為026160674，規(guī)格為每片2.5 mg）；咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為190706，規(guī)格為每支3 g；凡士林（濟(jì)寧百川化工有限公司，批號(hào)為200124）；腫瘤壞死因子-β（TNF-β）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、白細(xì)胞介素17（IL-17）、白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，批 號(hào) 分 別 為 20191023，20190921，20190915，20191018）；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及CD3+抗體試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為AE90282Ra，AE99106Ra）；一 抗 孤 獨(dú) 核 受 體 γt（RORγt），F(xiàn)oxp3（美國(guó)CST 公司，批號(hào)分別為185632，185921）。生地（批號(hào)為200302）、熟地（批號(hào)為200219）、白蒺藜（批號(hào)為200206）、知母（批號(hào)為200118）、黃柏（批號(hào)為200311）、獨(dú)活（批號(hào)為200210）、枸杞子（批號(hào)為2003008）、菟絲子（批號(hào)為2001250）、川牛膝（批號(hào)為200207）飲片均購(gòu)自衡水市醫(yī)藥藥材有限公司。

動(dòng)物：SPF 級(jí)BALB／c 小鼠60 只，雌性，6 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于河北中旭檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)SYXK（冀）2020-009。飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中。經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用原則。

1.2 方法

復(fù)制模型與分組給藥：將60 只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、甲氨蝶呤組（1 mg／kg），以及祛風(fēng)地黃湯低、中、高劑量組（8.76，17.55，35.10 g／kg），各10 只。小鼠背部剃毛，形成約2 cm×2 cm 大小的裸露區(qū)域，空白對(duì)照組小鼠每日定時(shí)涂抹等量凡士林42 mg；其余各組小鼠涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg，每日1 次，連續(xù)8 d，以復(fù)制銀屑病小鼠模型。涂抹1 h 后，各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物或等體積0.9%氯化鈉溶液（0.1 mL／10 g），連續(xù)8 d。

銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）：每日觀察并拍照記錄各組小鼠的皮損變化，參照PASI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］對(duì)模型小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)增厚程度進(jìn)行評(píng)分，無為0 分，輕度為1 分，中度為2 分，重度為3 分，極重度為4 分，統(tǒng)計(jì)3 項(xiàng)積分總和。

組織病理學(xué)觀察：于小鼠眼球取血，并處死，取部分背部皮膚組織，以多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，作5 μm 切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察皮損組織病理形態(tài)并拍照。

血清TNF-β，IL-10，IL-17，IL-6 水平測(cè)定：于小鼠眼球取血，離心，分離血清，按試劑盒說明書操作。樣品孔加入待檢血清10 μL，稀釋液40 μL，抗體100 μL，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h，洗滌劑洗板5 次，加入底物液100 μL，37 ℃孵育15 min，顯色，各孔加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD）值。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)、OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)濃度，求相應(yīng)含量。

PCNA 和CD3陽(yáng)性表達(dá)測(cè)定：采用免疫組織化學(xué)法。取小鼠背部皮損組織于4%甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，作5 μm 石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟，透明，脫水后，以過氧化氫孵育20 min，抗原熱修復(fù)，BSA 封閉20 min，一抗4 ℃條件下過夜，二抗37 ℃條件下孵育20 min，SABC 37 ℃條件下孵育20 min，DAB 顯色后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，每例標(biāo)本隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)PCNA 和CD3的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。

RORγt 和Foxp3 蛋白表達(dá)測(cè)定：采用Western blot法。取小鼠背部皮損組織，勻漿后加入RIPA 裂解液提取總蛋白，以BCA 法測(cè)定蛋白含量。取10 μL 蛋白樣品上樣，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗（1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST 清洗3 次，加入二抗（1 ∶5 000），室溫孵育2 h，回收二抗，TBST 清洗3 次，以顯色劑顯影。Image J 軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以X±s 表示，行單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮損情況

空白對(duì)照組小鼠皮膚平坦光滑，無紅斑、鱗屑及增厚改變。模型組小鼠皮膚褶皺，皮損處可見明顯鱗屑、紅斑、皮膚增厚隆起的銀屑病樣改變。甲氨蝶呤組及祛風(fēng)地黃湯低、中、高劑量組小鼠的皮損癥狀明顯減輕，紅斑逐漸消退，鱗屑脫落，皮膚增厚減退，皮損癥狀改善情況隨著祛風(fēng)地黃湯給藥劑量的增大而更加明顯。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠PASI 評(píng)分顯著升高（P ＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組及祛風(fēng)地黃湯低、中、高劑量組小鼠PASI 評(píng)分均顯著降低（P ＜0.01）。詳見圖1。

2.2 小鼠皮損組織病理學(xué)

a.空白對(duì)照組 b.模型組 c.甲氨蝶呤組 d.祛風(fēng)地黃湯低劑量組 e.祛風(fēng)地黃湯中劑量組 f.祛風(fēng)地黃湯高劑量組A.皮損圖片 B.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)注：與空白對(duì)照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01。下圖、下表同。圖1 各組小鼠背部皮損變化及PASI 評(píng)分a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction medium-dose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Skin lesion pictures B.Statistical dataNote：Compared with those in the blank control group，**P ＜0.01；compared with those in the model group，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01，as well as the following figures and tables.Fig.1 Changes of back skin lesions and PASI score of mice in each group

a.空白對(duì)照組 b.模型組 c.甲氨蝶呤組 d.祛風(fēng)地黃湯低劑量組 e.祛風(fēng)地黃湯中劑量組 f.祛風(fēng)地黃湯高劑量組圖2 各組小鼠皮損組織病理學(xué)觀察（HE，×200）a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction mediumdose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupFig.2 Histopathological observation of skin lesions of mice in each group（HE，×200）

空白對(duì)照組小鼠皮膚組織的表皮層薄，細(xì)胞浸潤(rùn)少。模型組小鼠表皮細(xì)胞層明顯增厚，真皮層可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，皮損組織呈銀屑病樣改變。甲氨蝶呤組及祛風(fēng)地黃湯低、中、高劑量組小鼠皮損表皮層較模型組平整，增厚減小，真皮層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。詳見圖2。

2.3 小鼠血清炎性因子水平

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-β 和IL-10 水平均顯著降低，IL-17 和IL-6 水平均顯著升高（P ＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組及祛風(fēng)地黃湯低、中、高劑量組小鼠血清中TNF-β 和IL-10 水平均顯著升高，IL-17 和IL-6 水平均顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.01）。詳見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-β，IL-10，IL-17，IL-6 水平比較（± s，ng／mL，n ＝10）Tab.1 Comparison of serum TNF-β，IL-10，IL-17 and IL-6 levels in each group（± s，ng／mL，n ＝10）

表1 各組小鼠血清中TNF-β，IL-10，IL-17，IL-6 水平比較（± s，ng／mL，n ＝10）Tab.1 Comparison of serum TNF-β，IL-10，IL-17 and IL-6 levels in each group（± s，ng／mL，n ＝10）

2.4 小鼠皮損組織PCNA 表達(dá)水平

空白對(duì)照組小鼠表皮層較薄，基底層可見PCNA 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，呈線性分布。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠皮損組織的表皮著色細(xì)胞層數(shù)顯著增加，陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布于表皮層，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多（P ＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組及祛風(fēng)地黃湯低、中、高劑量組小鼠皮損組織的表皮著色細(xì)胞層數(shù)較模型組顯著減少，陽(yáng)性細(xì)胞多分布于基底層，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P ＜0.01）。詳見圖3。

2.5 小鼠皮損組織CD3+表達(dá)水平

空白對(duì)照組小鼠皮膚的真皮層可見少量CD3+細(xì)胞零星分布。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚的真皮層CD3+表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組及祛風(fēng)地黃湯中、高劑量組小鼠皮膚的真皮層CD3+表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.01，P ＜0.05）。詳見圖4。

2.6 小鼠皮損組織RORγt 和Foxp3 蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠皮損組織中RORγt蛋白表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)oxp3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組及祛風(fēng)地黃湯低、中、高劑量組小鼠皮損組織中RORγt 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P ＜0.01），F(xiàn)oxp3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P ＜0.01）。詳見圖5。

3 討論

a.空白對(duì)照組 b.模型組 c.甲氨蝶呤組 d.祛風(fēng)地黃湯低劑量組 e.祛風(fēng)地黃湯中劑量組 f.祛風(fēng)地黃湯高劑量組A.PCNA 表達(dá) B.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)圖3 各組小鼠皮損組織中PCNA 的表達(dá)（HE，×200）a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction mediumdose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Expression of PCNA B.Statistical dataFig.3 Expression of PCNA in skin lesions of mice in each group（HE，×200）

a.空白對(duì)照組 b.模型組 c.甲氨蝶呤組 d.祛風(fēng)地黃湯低劑量組 e.祛風(fēng)地黃湯中劑量組 f.祛風(fēng)地黃湯高劑量組A.CD3+表達(dá) B.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)圖4 各組小鼠皮損組織中CD3+的表達(dá)（HE，×200）a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction medium-dose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Expression of CD3+ B.Statstical dataFig.4 Expression of CD3+ in skin lesions of mice in each group（HE，×200）

a.空白對(duì)照組 b.模型組 c.甲氨蝶呤組 d.祛風(fēng)地黃湯低劑量組 e.祛風(fēng)地黃湯中劑量組 f.祛風(fēng)地黃湯高劑量組A.電泳圖 B，C.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)圖5 小鼠皮損組織中RORγt 和Foxp3 的蛋白表達(dá)a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction mediumdose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Electrophoretic chart B，C.Statistical dataFig.5 Expression of RORγt and Foxp3 protein in skin lesions of mice

銀屑病在全球的發(fā)病率為2%～3%，且有逐年上升趨勢(shì)［7］。該病多以對(duì)癥治療控制復(fù)發(fā)為主，如用卡泊三醇、維A 酸、糖皮質(zhì)激素類等外用軟膏，內(nèi)服抗生素、免疫抑制劑等內(nèi)用藥，以及光化學(xué)療法、水療法等物理療法進(jìn)行治療［8］。銀屑病需長(zhǎng)期治療，而各種療法都有一定程度的不良反應(yīng)，且停藥后易復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)期療效較差［2］。中藥復(fù)方治療本病能有效降低復(fù)發(fā)率，縮短病程，其具體機(jī)制亟待進(jìn)一步探究［3］。銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中免疫細(xì)胞的分化異常是關(guān)鍵［9］，而Th17 及Treg 免疫功能失調(diào)是近年來的研究熱點(diǎn)。Th17 和Treg 細(xì)胞均屬CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群，二者關(guān)系密切，功能上相互制約，在正常機(jī)體中保持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)［10］。銀屑病患者外周血及皮損區(qū)存在Th17 型細(xì)胞因子的過度活化，同時(shí)Treg 細(xì)胞的活性及功能受到抑制［11］。Th17 所分泌的IL-17 和IL-6 等促炎因子能放大炎性反應(yīng)，促進(jìn)銀屑病局部皮損的炎性浸潤(rùn)［12］。Treg 能通過表達(dá)IL-10、TNF-β 等抑炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，抑制T 細(xì)胞的增殖分化，減輕過度免疫及炎性反應(yīng)［13］。RORγt 和Foxp3 為Th17 和Treg 細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)能直接反映Th17 與Treg 細(xì)胞的功能與活性［14］。RORγt 的過度表達(dá)可誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生，F(xiàn)oxp3 是Treg 細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的重要蛋白，二者比例的失調(diào)與Th17／Treg 細(xì)胞失衡密切相關(guān)。當(dāng)RORγt 表達(dá)水平持續(xù)上升、Foxp3 表達(dá)水平不斷下降時(shí)，最終導(dǎo)致Treg ／Th17 細(xì)胞免疫失衡，使皮膚炎癥進(jìn)一步加重，成為皮損反復(fù)遷延的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［15］。

咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型所產(chǎn)生的皮損形態(tài)、組織病理學(xué)變化及免疫細(xì)胞因子表達(dá)等均與人類銀屑病極相似，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的銀屑病研究動(dòng)物模型［18］。本研究結(jié)果顯示，祛風(fēng)地黃湯能明顯改善小鼠的皮損癥狀及PASI 評(píng)分，減輕皮損組織表皮層增厚及真皮層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，角質(zhì)細(xì)胞異常增殖與活化是引起銀屑病表皮增厚的主要原因，PCNA 是反映皮損組織細(xì)胞增殖活躍程度的指標(biāo)［19］。免疫組化結(jié)果可見，經(jīng)祛風(fēng)地黃湯治療后，小鼠皮損組織中PCNA 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著減少，多分布于基底層，提示祛風(fēng)地黃湯能抑制銀屑病模型小鼠表皮細(xì)胞的增殖分化。真皮層T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及其免疫功能異常是銀屑病的重要特征［20］，祛風(fēng)地黃湯各劑量組小鼠真皮層CD3+T 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著減少，表明祛風(fēng)地黃湯能抑制T 細(xì)胞過度增殖，減輕真皮層T 細(xì)胞浸潤(rùn)，從而改善皮膚免疫反應(yīng)，緩解小鼠皮損癥狀。ELISA 及Western blot 試驗(yàn)結(jié)果顯示，祛風(fēng)地黃湯能有效降低模型小鼠血清中IL-17 和IL-6水平，升高TNF-β 和IL-10 水平，同時(shí)下調(diào)小鼠皮損組織中RORγt 蛋白的表達(dá)，上調(diào)Foxp3 蛋白的表達(dá)，提示祛風(fēng)地黃湯可能通過降低Th17 細(xì)胞因子和RORγt的表達(dá)，同時(shí)恢復(fù)Treg 細(xì)胞活性及其功能蛋白Foxp3的表達(dá)，從而抑制T 細(xì)胞向Th17 型細(xì)胞分化，糾正Th17／Treg 細(xì)胞免疫失衡，發(fā)揮對(duì)模型小鼠皮損的改善作用。

綜上所述，祛風(fēng)地黃湯對(duì)模型小鼠銀屑病樣皮損具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th17／Treg 免疫失衡有關(guān)。