葉壵敏，林 娜，張曉芹△，石森林

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬麗水市中醫(yī)院，浙江 麗水 323000）

真菌毒素污染是影響食品安全的重要因素［1］，其中黃曲霉、寄生曲霉等真菌所產(chǎn)生的黃曲霉素具有高致癌性、致病性，廣泛存在于玉米、花生、木耳、大豆等食品中，是威脅人類健康的首要真菌毒素［2-4］。黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的快速檢測和防治是目前真菌毒素污染領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。當(dāng)前對(duì)黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)或免疫學(xué)方法。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法主要基于菌株形態(tài)、生理特征等進(jìn)行鑒別，耗時(shí)耗力，且需要的經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)；免疫學(xué)方法主要依靠黃曲霉素的抗性特點(diǎn)進(jìn)行檢測，檢測樣品需經(jīng)純化、孵育等多個(gè)環(huán)節(jié)，檢測周期長、操作復(fù)雜［5-7］。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的快速檢測提供了新途徑。孫長坡等［8］、MAHMOUD 等［9］，AHMAD 等［10］等分別基于RFLP、SSR、功能基因等對(duì)不同真菌進(jìn)行了鑒定。多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法是指在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測出2 種以上目的基因的方法，具有高效、快速、高通量等優(yōu)勢［11-14］。從黃曲霉素的生物合成途徑分析，雜色曲霉B（VerB）、雜色曲霉1（Ver-1）是黃曲霉素產(chǎn)生的關(guān)鍵基因［15-19］，對(duì)這2 個(gè)基因進(jìn)行及時(shí)檢測也是鑒定黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的關(guān)鍵；ITS 基因是真菌通用基因，可通過該基因測序有效排除假陽性和假陰性。目前尚無針對(duì)以上3 種基因開展黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的多重PCR 體系研究。DNA 質(zhì)量是影響多重PCR 的主要因素，CTAB［20］、SDS［21］及相關(guān)改良方法是目前常用的總DNA 提取方法，不同研究對(duì)象常需采用相應(yīng)提取方法方可獲得高質(zhì)量總DNA。為此，本研究中擬在考察了最佳DNA 提取方式的基礎(chǔ)上，基于VerB，Ver-1，ITS 基因序列設(shè)計(jì)多重PCR 引物，建立黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的多重PCR 檢測體系，為該類真菌的分子鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：MJ-150-II 型霉菌培養(yǎng)箱、HZQ-X300C 型恒溫振蕩器、DK-8D 型三孔電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；GenoSens 1850 型凝膠成像儀（北京勤翔生物技術(shù)有限公司）；NanoDrop 2000 型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher 公司）；T100 型PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；GNJS-Ⅱ型菌落計(jì)數(shù)器（上海谷寧儀器有限公司）。

試劑：dNTP、Taq 酶、DNA Marker 及真菌、植物基因組DNA 提取試劑盒，均購自上海生工生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為GA14KA7272，AK71529A，H701KA0592，H111KA8418，GB16KA7790）。細(xì)菌瓊脂粉、胰蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體（SDB）培養(yǎng)基，均購自杭州水露生物科技有限公司。

菌株：包括黃曲霉Aspergillus flavus AS 3.3554、寄生曲霉 Aspergillus parasiticus AS 3.124、土曲霉Aspergillus terreus AS 3.3935、雜色曲霉Aspergillus versicolor AS 3.3886、紅曲霉Monascus sp AS 3.782、煙曲霉Aspergillus fumigatus AS 3.3572、毛 霉 Mucor AS 3.3447、鏈格孢霉Alternaria AS 3.4255、青霉Penicillium expansum AS 3.3875、黑曲霉Aspergillus niger CMCC（F）98003 和構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans AS 3.3916，均購自杭州水露生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將1.1 項(xiàng)下11 種菌株分別接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)5～7 d，以菌落計(jì)數(shù)器觀察各菌株的生長情況。

1.2.2 不同DNA 提取方法考察

提取試劑盒考察：分別用Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒、Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取各菌株DNA，各菌株DNA 采用液氮研磨的取材方式，以DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和ITS 基因序列結(jié)果評(píng)價(jià)提取試劑盒的優(yōu)劣。

處理方式考察：采用提取效果較優(yōu)的試劑盒，評(píng)價(jià)DNA 不同取材方式對(duì)總DNA 提取的影響。即對(duì)平皿培養(yǎng)后的菌落采取以下3 種取材方式，直接將菌絲從平皿上刮下，放入2 mL 離心管中，進(jìn)行DNA 提??；用提取試劑盒中的buffer PCB 將斜面培養(yǎng)的菌絲溶解，取溶解液適量置2 mL 離心管中，進(jìn)行DNA 提??；平皿上的菌絲轉(zhuǎn)移至研缽內(nèi)，液氮研磨后再用試劑盒提取?？侱NA 提取產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.3 目標(biāo)基因引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

根據(jù)Ver-1，VerB，ITS 序列，通過引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的多重PCR 引物（見表1），引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的多重PCR 目標(biāo)基因及引物Tab.1 Multiplex PCR target genes and primers of aflatoxigenic fungi

1.2.4 單重PCR 檢測的特異性與靈敏度測定

PCR 反應(yīng)體系：10.0 μL 5 ×PCR buffer，5.0 μL 10 mmol／L dNTP，5 μmol／μL 引物2 μL，4 μL 25 mmol／L MgCl2，0.5 μL Taq 酶（5 U ／ μL），1 μL DNA模板（10 ng／μL），加ddH2O 至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物純度。

以1.1 項(xiàng)下11 種菌株的DNA 為模板，在不同反應(yīng)管中分別擴(kuò)增Ver-1（800 bp）、VerB（1 000 bp）、ITS（600 bp）目標(biāo)基因片段，測定單基因PCR 的特異性。以濃度確定的黃曲霉菌株基因組DNA（20 ng／μL）為模板，按質(zhì)量濃度1 pg／μL～10 ng／μL 進(jìn)行梯度稀釋，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測單基因PCR 擴(kuò)增的靈敏性。

1.2.5 多重PCR 特異性與靈敏性測定

以1.1 項(xiàng)下11 種菌株的DNA 為模板，在同一反應(yīng)管中同時(shí)進(jìn)行Ver-1（800 bp）、VerB（1 000 bp）、ITS（600 bp）目標(biāo)基因片段的擴(kuò)增，測定多重PCR 的特異性。以濃度確定的黃曲霉菌株基因組DNA（20 ng／μL）為模板，依次稀釋至10，1 ng／μL，100，10，1，0.1 pg／μL，然后分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR 擴(kuò)增的靈敏度。

1.2.6 多重PCR 檢測的重復(fù)性與穩(wěn)定性測定

平行提取3 份黃曲霉菌株DNA，按上述條件進(jìn)行單管多重PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證體系的重復(fù)性；分別在第1，4，7 天用同一份黃曲霉菌株DNA 進(jìn)行單管多重PCR 檢測，驗(yàn)證體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 菌株培養(yǎng)

各菌株培養(yǎng)結(jié)果見圖1。

2.2 DNA 提取方法比較

試劑盒優(yōu)選：將1.1 項(xiàng)下11 種菌株用液氮研磨后，分別采用Ezup 柱式真菌基因組抽提試劑盒和Ezup 柱式植物基因組抽提試劑盒進(jìn)行總DNA 的提取。結(jié)果采用真菌基因組抽提試劑盒的DNA 條帶顯示率為100%，采用植物基因組抽提試劑盒的DNA 條帶顯示率為50%（見圖2）；以真菌共有ITS 序列為目標(biāo)基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果采用真菌基因組抽提試劑盒的ITS 擴(kuò)增率為100%，而采用植物基因組抽提試劑盒，ITS 擴(kuò)增率為66.7%（見圖3）。故選用真菌基因組抽提試劑盒提取。

A.黑曲霉 B.青霉 C.毛霉 D.寄生曲霉 E.紅曲霉 F.黃曲霉 G.雜色曲霉 H.煙曲霉 I.土曲霉 J.構(gòu)巢曲霉 K.鏈格孢霉圖1 各菌株培養(yǎng)結(jié)果（×100）A.Aspergillus niger B.Penicillium expansum C.Mucor D.Aspergillus parasiticus E.Monascus F.Aspergillus flavus G.Aspergillus versicolor H.Aspergillus fumigatus I.Aspergillus terreus J.Aspergillus nidulans K.AlternariaFig.1 Culture results of each strain（×100）

A.Ezup 柱式真菌基因組抽提試劑盒 B.柱式植物基因組抽提試劑盒Marker圖2 兩種不同試劑盒DNA 瓊脂糖凝膠圖像A.Ezup column fungal genome extraction kit B.Column plant genome extraction kit MarkerFig.2 DNA agarose gel images of two different kits

取材方式：采用Ezup 柱式真菌基因組抽提試劑盒提取各菌的DNA，按1.2.2 項(xiàng)下方法處理樣品。結(jié)果第1 種取材方式總DNA 直接電泳，條帶顯示率為16.7%，第2 種為50.0%，第3 種為100.0%（見圖4）；以真菌共有ITS 序列為目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果第1 種取材方式ITS 擴(kuò)增率為75.0%，第2 種為91.7%，第3 種為100.0%（見圖5）。故選用液氮研磨法處理樣品。

2.3 單重PCR 檢測特異性與基因序列比對(duì)

將11 種 菌株的DNA 用3 個(gè)引物（ITS，Ver-1，VerB）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，僅黃曲霉和寄生曲霉出現(xiàn)3 個(gè)條帶，分別為600，800，1 000 bp 的特異片段，其余9 種僅獲得600 bp 的特異片段，詳見圖6。

測序后與GenBank 中已知基因序列對(duì)比（見圖7），可見600，800，1 000 bp 片段分別對(duì)應(yīng)的是各菌株的ITS 片段、黃曲霉和寄生曲霉的Ver-1 與VerB 基因序列，表明針對(duì)目的DNA 片段檢測的引物設(shè)計(jì)成功。

2.4 多重PCR 檢測的特異性及靈敏性

特異性分析：將1.1 項(xiàng)下11 種菌株以液氮研磨處理，按1.2.4 項(xiàng)下方法擴(kuò)增（圖8 A）。黃曲霉、寄生曲霉是已知可產(chǎn)毒的菌株，均出現(xiàn)了3 個(gè)條帶（泳道1 和2），除了構(gòu)巢曲霉ITS 條帶較弱以外，其余菌株均僅出現(xiàn)了1 個(gè)明亮的ITS 條帶（泳道3～11）。

靈敏性分析：將已知濃度的黃曲霉DNA 進(jìn)行梯度稀釋（0.1 pg／μL～10 ng ／ μL），按1.2.4 項(xiàng)下方法擴(kuò)增（見圖8 B）。結(jié)果表明，在DNA 質(zhì)量濃度達(dá)到1 ng／μL 時(shí)，出現(xiàn)明亮的多重條帶（泳道5）；而DNA 質(zhì)量濃度在0.1 ng／μL 時(shí)，ITS 條帶亮度很弱，另外2 個(gè)目標(biāo)條帶則完全不顯現(xiàn)（泳道4）。

A.第1 種 B.第2 種 C.第3 種圖5 不同取材方式下各菌株的ITS 圖像A.The first kind B.The second kind C.The third kindFig.5 ITS images of each strain under different sampling methods

1.ITS 2.Ver-1 3.VerB圖6 11 種菌株3 個(gè)目的基因單重PCR 檢測結(jié)果1.ITS 2.Ver-1 3.VerBFig.6 Single PCR detection results of target genes of 11 strains

2.5 多重PCR 檢測的重復(fù)性與穩(wěn)定性

平行提取3 份黃曲霉的DNA，進(jìn)行多重PCR 檢測（圖9 A）。取同1 份黃曲霉總DNA，分別在第1，4，7 天進(jìn)行PCR 檢測（圖9 B）。結(jié)果表明，所建立的體系連續(xù)3 次檢測結(jié)果一致，且在7 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1 DNA 提取方式對(duì)多重PCR 體系的影響

DNA 質(zhì)量對(duì)多重PCR 結(jié)果的影響較大，常用的DNA 提取方式有CTAB 法、SDS 法、改良SDS 法等，本研究中根據(jù)DNA 提取方式的不同，考察了2 種提取試劑盒，發(fā)現(xiàn)以CTAB 法為原型的Ezup 柱式提取試劑盒所提取的DNA 效果更佳。

以真菌為原材料的DNA 提取主要有菌株凍干粉直接提取、菌株復(fù)蘇培養(yǎng)后收集菌絲體提取、菌株培養(yǎng)后菌絲體用液氮研磨后提取等多種方式，本研究中對(duì)不同提取方式均進(jìn)行了嘗試，結(jié)合實(shí)際發(fā)現(xiàn)，菌株用平皿擴(kuò)大培養(yǎng)后，刮取菌落用液氮研磨后再提取DNA，所得總DNA 質(zhì)量最佳。原因可能是真菌的細(xì)胞裂解程度相關(guān)，液氮冷凍處理后，再加裂解液水浴，可顯著提高細(xì)胞破碎度、增加DNA 溶出率，從而提高DNA 產(chǎn)量。

3.2 引物設(shè)計(jì)對(duì)多重PCR 體系的影響

在進(jìn)行黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的檢測中發(fā)現(xiàn)，若想獲得高靈敏度、高重復(fù)性、高穩(wěn)定性的PCR 體系，優(yōu)質(zhì)、合適的引物也是關(guān)鍵。本研究初期共設(shè)計(jì)了20 對(duì)引物，通過單重PCR 篩選，最終獲得3 條最佳引物。在引物設(shè)計(jì)中，將引物長度控制在18～27 bp、產(chǎn)物長度控制在200～500 bp、引物GC 含量控制在40%～60%，并盡量減少引物二聚體的形成和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成，可有效提高引物有效性和特異性。

A.ITS B.Ver-1 C.VerB圖7 基因序列比對(duì)結(jié)果A.ITS B.Ver-1 C.VerBFig.7 Results of gene sequence alignment

綜上所述，本研究中設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性，且引物靈敏度較高，平行重復(fù)3 次，均可呈現(xiàn)明亮條帶，7 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。這說明建立的多重PCR體系具有較好的適用性，可用于后續(xù)黃曲霉素產(chǎn)毒真菌的檢測。

A.特異性 B.靈敏性注：圖A 中，1-11 分別為黃曲霉、寄生曲霉、土曲霉、雜色曲霉、紅曲霉、煙曲霉、毛霉、鏈格孢酶、青霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉；圖B 中1-6 分別為0.1，1，10，100 pg／μL，1，10 ng／μL。圖8 多重PCR 檢測各菌株基因組基因特異性與靈敏性檢測A.Specificity B.SensitivityNote：In Fig.A，1 -11 respectively represent Aspergillus flavus，Aspergillus parasiticus，Aspergillus terreus，Aspergillus versicolor，Monascus，Aspergillus fumigatus，Mucor，Alternaria，Penicillium expansum，Aspergillus niger and Aspergillus nidulans；In Fig.B，1-6 respectively represent 0.1 pg／μL，1 pg／μL，10 pg／μL，100 pg／μL，1 ng／μL，10 ng／μL.Fig.8 Multiplex PCR detection of gene specificity and sensitivity of each strain genome

A.重復(fù)性 B.穩(wěn)定性注：圖A 中，1～3 分別表示平行提取的3 份黃曲霉DNA 樣品，圖B 中，1～3 分別表示第1、4、7 天用同一份DNA 進(jìn)行多重PCR。圖9 多重PCR 檢測的重復(fù)性與穩(wěn)定性A.Repeatability B.StabilityNote:In Fig.A，1-3 respectively represent the three Aspergillus flavus DNA samples extracted in parallel，and in Fig.B，1-3 respectively represent the multiplex PCR with the same DNA on day 1，4 and 7.Fig.9 Repeatability and stability of multiplex PCR detection