趙培西，唐仕浩，趙 華，趙 斌，張 艷，楊鐵林，郭 燕△，張一力

（1.陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院·生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710049）

胃癌是全球第五大癌癥，每年超100 萬患者確診［1］。東亞是胃癌患者集中的地區(qū)之一［2］。胃癌的治療以手術(shù)為主，術(shù)后或不適合手術(shù)的患者也可采用藥物治療，對胃癌有效的化學(xué)治療（簡稱化療）藥物包括氟嘧啶類、鉑類、紫杉烷類和伊立替康［2］。但西藥常伴各種藥品不良反應(yīng)，如卡培他濱會(huì)導(dǎo)致手足綜合征［3］，奧沙利鉑與精神類疾病和腹瀉相關(guān)［4］。中藥具有抑制癌細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)其凋亡的作用［5-7］，且藥性溫和，藥品不良反應(yīng)較少，逐漸受到大眾重視。八珍湯別名八珍散，載于多本醫(yī)方著作，其由人參、白術(shù)、白茯苓、當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃、甘草組方，對胃癌有一定療效［8-10］，但因該方成分多樣、作用靶點(diǎn)繁復(fù)，具體機(jī)制仍未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)、完整地揭示中藥治療疾病的作用機(jī)制。本研究中探討了八珍湯治療胃癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP）上，分別以“人參”“白術(shù)”“茯苓”“當(dāng)歸”“川芎”“白芍”“熟地黃”“甘草”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，篩選條件為藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18。將得到的靶點(diǎn)在Uniprot 網(wǎng)站（https：／ ／www.uniprot.org／）中轉(zhuǎn)換為對應(yīng)ID，同時(shí)排除部分指代不明或非“Homo sapiens”的靶點(diǎn)。

1.2 作用靶點(diǎn)預(yù)測及生物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

預(yù)測篩選后的黃芪主要生物活性成分的作用靶點(diǎn)，根據(jù)TCMSP 提供的靶點(diǎn)，利用網(wǎng)絡(luò)繪圖軟件Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建主要生物活性成分-靶點(diǎn)的作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

構(gòu)建藥物直接靶點(diǎn)與其他蛋白間的PPI 網(wǎng)絡(luò)，通過String 數(shù)據(jù)庫對藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，篩選條件為互作分?jǐn)?shù)大于0.9。

1.4 目標(biāo)基因富集分析

京都基因與基因組百科全書（KEGG）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。通過KEGG富集分析得到相關(guān)的代謝通路。使用metascape 網(wǎng)站（https：／ ／metascape.org／），Min Overlap 選擇3，P 值選擇0.01，MinEnrichment 選擇1.5，進(jìn)行在線KEGG 通路分析。

基因本體論（GO）分析中將基因功能分成生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）三部分。將上一步得到的所有靶點(diǎn)作為輸入，使用David6.8（https：／ ／david.ncifcrf.gov ／ ）在線功能注釋工具進(jìn)行GO 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分檢索

得復(fù)方八珍湯組方中各中藥的主要成分150 種，其中人參22 種、白術(shù)7 種、茯苓15 種、當(dāng)歸2 種、川芎7 種、白芍13 種、熟地黃2 種、甘草92 種。

2.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

得到8 種中藥的對應(yīng)作用靶點(diǎn)，與2.1 項(xiàng)下篩選得到主要成分進(jìn)行匹配，在Uniprot 網(wǎng)站中對對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，選擇物種“Homo sapiens”，排除重復(fù)的和指代不明的靶點(diǎn)后，得到238 個(gè)靶點(diǎn)，共計(jì)2 035 個(gè)對應(yīng)關(guān)系（圖1）。其中“共有”表示該成分在多種中藥中均存在，當(dāng)歸和熟地?zé)o特有成分，故未單獨(dú)標(biāo)出。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)示意圖Fig.1 Schematic diagram of active ingredient-target network

2.3 PPI 分析

篩選互作分?jǐn)?shù)大于0.9 的PPI pairs，238 個(gè)藥效分子靶點(diǎn)基因中有230 個(gè)與4 968 個(gè)疾病靶點(diǎn)間有相互作用，這種作用關(guān)系達(dá)22 795 個(gè)。其中，按degree 值排序排名前15的蛋白為TP53（590），MAPK1（532），CDC42（504），MAPK3（451），HSP90AA1（409），AKT1（404），JUN（387），CHRM2（380），STAT3（376），CXCL8（370），RELA（365），EGFR（361），MAPK14（336），CCNB1（327），APOB（324）。

2.4 KEGG 通路與GO 富集分析

將KEGG 分析到的通路按P 值由小到大排列，選取前20 位進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖2。八珍湯對應(yīng)靶點(diǎn)與癌癥通路富集結(jié)果顯著性最強(qiáng)，同時(shí)與MAPK 通路、cAMP 通路等細(xì)胞增殖分化和凋亡過程相關(guān)。以癌癥通路為例，可觀察到在PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的均在該通路中被富集，如TP53，MAPK1 和MAPK3（圖中ERK），CDC42，HSP90AA1（圖中HSP）等，詳見圖3。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05 為界篩選FDR 最小的10 條通路進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果見圖4。表明八珍湯作用靶點(diǎn)與癌癥通路高度相關(guān)。

圖2 KEGG 通路分析結(jié)果Fig.2 Results of KEGG pathway analysis

圖3 癌癥通路示意圖Fig.3 Schematic diagram of cancer pathways

圖4 GO 富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO enrichment analysis

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)主要模塊分析

利用cytoscape 軟件中MCODE 插件對2.3 項(xiàng)下得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析，degree cutoff 選擇3，其他參數(shù)默認(rèn)，最終得到16 個(gè)主要模塊，其中得分大于5 的有模塊A（6.189 分，含75 個(gè)蛋白）和模塊B（6.036 分，含221 個(gè)蛋白）。

為進(jìn)一步探究模塊中蛋白的功能，進(jìn)行KEGG 通路分析，按顯著性排序繪圖，結(jié)果圖6。其中與總體KEGG 分析結(jié)果相比，在腫瘤及細(xì)胞增殖周期相關(guān)的通路同樣在這里得到了富集。

3 討論

A.模塊A B.模塊B圖5 PPI 主要模塊分析A.Module A B.Module BFig.5 Analysis of PPI main modules

本研究中初步篩選出八珍湯活性成分150 個(gè)，繼而挖掘出238 個(gè)靶點(diǎn)基因及相互作用關(guān)系2 035 個(gè)，表明中藥復(fù)方作用機(jī)制具有多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。PPI 分析所得degree 前15 名蛋白多與胃癌相關(guān)，以排名前3的蛋白為例：TP53 是由抑癌基因TP53 編碼的［11］，與腫瘤形成密切相關(guān)；有研究表明，胃癌患者的MAPK1 水平顯著上升，同時(shí)抑制MAPK1 的表達(dá)水平會(huì)抑制胃癌細(xì)胞的增殖［12］，CDC42 蛋白屬細(xì)胞分裂周期蛋白，可激活下游MAPK／ERK 通路、PI3K／AKT 通路和PTEN 通路，在胃癌的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［13］。同時(shí)，這3 種蛋白都是槲皮素的靶點(diǎn)，槲皮素在八珍湯中是甘草的特有成分，已有甘草提取物能抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的報(bào)道［14］。KEGG 通路分析中也得到了類似結(jié)果，除與腫瘤形成和轉(zhuǎn)錄直接相關(guān)的通路外，細(xì)胞生長凋亡及信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)通路如MAPK 通路、cAMP 通路［15］、AMPK 通路［16］也得到類似顯著結(jié)果。這些通路均被證實(shí)在胃癌形成或治療過程中的作用，證明了本研究與生物醫(yī)學(xué)研究可相互印證。GO 富集分析中，細(xì)胞對藥物等的反應(yīng)在BP 中排名靠前，說明這些蛋白主要參與細(xì)胞基礎(chǔ)活動(dòng)，同時(shí)對內(nèi)源性刺激應(yīng)答進(jìn)行調(diào)控；MF 分析表明，這些靶點(diǎn)主要參與酶、蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和藥物結(jié)合過程；CC 分析顯示，它們與細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)相關(guān)的通路有關(guān)。

A.模塊A B.模塊B圖6 PPI 主要模塊蛋白KEGG 通路分析結(jié)果A.Module A B.Module BFig.6 Results of KEGG pathway analysis of PPI main module protein

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析能揭示八珍湯在抗胃癌過程中可能的機(jī)制，并找到關(guān)鍵靶蛋白，為后續(xù)研究提供重要的理論依據(jù)，也為藥物作用機(jī)制的研究和藥物研發(fā)提供了新思路和新方法。