張宗偉，溫海楠，陳東科，梁悅怡，孫立紅，劉焱超，謝守軍(.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院南區(qū)檢驗(yàn)科，河北承德 067000；.北京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京00000)

墨西哥假黃單胞菌為非發(fā)酵需氧革蘭陰性桿菌，可運(yùn)動，無芽孢，有端鞭毛，由Thierry等[1]在2004年首次發(fā)現(xiàn)并命名，該菌廣泛存在于自然界，由其引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染極為罕見，目前國內(nèi)外未見報道。本文首次報道1例自顱腦外傷患者的腦脊液中分離出墨西哥假黃單胞菌的罕見病例，實(shí)驗(yàn)室通過多種檢驗(yàn)技術(shù)、檢測方法對該菌進(jìn)行鑒定及研究，以期為疾病診斷提供病原學(xué)依據(jù)，并指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。

1 病歷資料

患者，男，50歲，因高處墜落傷后意識障礙4 h于2020年4月4日來承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診。外傷史明確，工作時由高處墜落摔傷，背部著地，鋼筋由左眼穿入，傷后患者呼之可應(yīng)，四肢可動，隨即出現(xiàn)意識障礙伴惡心、嘔吐，嘔吐物為唾液含少量鮮血，以“開放性顱腦損傷”收入神經(jīng)外科。入院后行手術(shù)治療，術(shù)后患者處于昏迷狀態(tài)。

患者術(shù)后留置頭皮下引流管，給予美羅培南1.0 g q8h聯(lián)合去甲萬古霉素800 mg q12h抗感染治療。4月20日患者出現(xiàn)間斷發(fā)熱，予以拔除頭皮引流管，留置腰大肌引流管引流腦脊液并留取腦脊液送檢常規(guī)及培養(yǎng)，4月27日回報該腦脊液增菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性?；颊哂?月29日停用萬古霉素。5月6日患者再次出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達(dá)38.9 ℃，取腰大池引流腦脊液送檢腦脊液常規(guī)，各項(xiàng)指標(biāo)提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。5月9日臨床考慮美羅培南應(yīng)用時間較長予以停用，改用氯霉素1.5 g q12h抗感染治療，并繼續(xù)留取腦脊液送檢腦脊液常規(guī)及培養(yǎng)，5月12日該腦脊液增菌培養(yǎng)見革蘭陰性桿菌生長，經(jīng)生物梅里埃質(zhì)譜儀鑒定為墨西哥假黃單胞菌。為排除引流管污染而導(dǎo)致腦脊液增菌培養(yǎng)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，5月13日患者行腰椎穿刺，留取腦脊液常規(guī)及培養(yǎng)，同日下午回報該腦脊液涂片革蘭染色鏡下見革蘭陰性桿菌，培養(yǎng)48 h后見墨西哥假黃單胞菌菌落生長。

5月14日依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室藥敏結(jié)果，加用美羅培南1.0 g q8h聯(lián)合氯霉素1.5 g q12h抗感染治療后，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及其他各項(xiàng)指標(biāo)均呈下降趨勢。5月20日送檢腦脊液增菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性，顯示抗感染治療有效。5月20日腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)再次出現(xiàn)小幅度增高，考慮氯霉素已應(yīng)用2周予以停用，依據(jù)抗菌譜加用左氧氟沙星聯(lián)合美羅培南抗感染治療后，病情好轉(zhuǎn)。6月1日再次送檢腦脊液培養(yǎng)結(jié)果為陰性。其后患者病情平穩(wěn)，于6月15日出院。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

5月6日患者腦脊液白細(xì)胞總數(shù)出現(xiàn)大幅度增高，達(dá)5 292×106/L，其中多個核細(xì)胞比例為75%，蛋白質(zhì)2.33 g/L，葡萄糖1.21 mmol/L，氯112 mmol/L，乳酸8.1 mmol/L，各項(xiàng)結(jié)果均提示細(xì)菌性腦膜炎。于5月9日留取腰大池引流腦脊液1～2 mL注入血培養(yǎng)兒童瓶，置于法國生物梅里埃公司BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀內(nèi)增菌培養(yǎng)，于培養(yǎng)68.40 h后報陽，培養(yǎng)瓶內(nèi)液體直接涂片革蘭染色，鏡下見革蘭陰性桿菌，同時轉(zhuǎn)種于血平板、中國藍(lán)平板和巧克力平板置于35 ℃條件下培養(yǎng)，24 h后見菌落生長。5月13日行腰椎穿刺留取腦脊液2 mL送檢腦脊液培養(yǎng)，3 000 r/min離心10 min后取沉淀接種于血平板、中國藍(lán)平板和巧克力平板，35 ℃培養(yǎng)48 h后見菌落生長。

5月13日使用法國生物梅里埃MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定儀(Vitek MS)與Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定儀分別對該菌進(jìn)行鑒定。Vitek MS鑒定結(jié)果為墨西哥假黃單胞菌，鑒定值為99.9%；Vitek 2 Compact GN卡鑒定結(jié)果為少動鞘氨醇單胞菌，鑒定值為68%。2種方法鑒定結(jié)果不一致，使用16S rDNA測序方法對鑒定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，引物序列為F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，經(jīng)北京睿博興科公司靶向DNA測序鑒定，結(jié)果經(jīng)Pubmed blast比對，顯示該序列與墨西哥假黃單胞菌(Pseudoxanthomonasmexicana)序列相似度為99.64%。

取單個菌落配制0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?，在M-H瓊脂上采用E-test法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果的判定參照2020年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI) M100非腸桿菌科細(xì)菌的藥敏折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示在所選擇的11種抗菌藥物中，該菌對除亞胺培南外的其他藥物均表現(xiàn)為敏感，藥敏結(jié)果見表1。

圖1 墨西哥假黃單胞菌革蘭染色

圖2 墨西哥假黃單胞菌培養(yǎng)48 h菌落形態(tài)

表1 墨西哥假黃單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

墨西哥假黃單胞菌為非發(fā)酵需氧革蘭陰性桿菌，35 ℃條件下在血瓊脂平板上生長良好，也可以在中國藍(lán)培養(yǎng)基上生長，但生長速度較血平板緩慢。血瓊脂平板上培養(yǎng)48 h后可見針尖大小、圓形、凸起、光滑濕潤、有草綠色溶血環(huán)的黃色菌落。本實(shí)驗(yàn)室E-test法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對除亞胺培南外的其他抗菌藥物均表現(xiàn)為敏感，與Thierry等[1]報道該菌對除氨基糖苷類外的大多數(shù)抗菌藥物敏感有所不同，產(chǎn)生這種差異的原因尚不清楚。該菌對美羅培南敏感而亞胺培南耐藥，有研究表明，少數(shù)因外膜蛋白D2(OprD2)缺失而對亞胺培南耐藥的菌株仍可對美羅培南敏感[2-3]，美羅培南與亞胺培南抗菌活性的差別可能與兩者對細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白親和力的不同，對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性不同以及對特定通道孔蛋白的穿透力不同有關(guān)[4-5]。

美羅培南對革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抗菌活性，對細(xì)胞外膜具有較強(qiáng)的穿透力,可通過血腦屏障[6]。張宇一[7]在使用不同劑量美羅培南治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的研究中發(fā)現(xiàn)，2.0 g q8h的給藥方案治療效果優(yōu)于1.0 g q6h及1.0 g q8h，且2 g q8h給藥方案的%T>MIC、Cmax/MIC及血腦屏障穿透率明顯高于其余二組給藥方案。在此病例中，該菌對美羅培南敏感，前期在使用美羅培南1.0 g q8h抗感染治療過程中發(fā)生墨西哥假黃單胞菌感染，可能是由于抗菌藥物使用劑量不足導(dǎo)致。聯(lián)合使用具有協(xié)同作用的抗菌藥物能夠顯著增加藥物療效[8]，在明確病原菌及藥物敏感性后，美羅培南先后聯(lián)合使用氯霉素和左氧氟沙星抗感染治療，協(xié)同治療效果顯著，患者病情好轉(zhuǎn)。

本病例中Vitek 2 Compact儀器將該菌誤鑒定為少動鞘氨醇單胞菌，主要原因可能為少動鞘氨醇單胞菌生化反應(yīng)特性與墨西哥假黃單胞菌有許多相似之處[9]。此外，墨西哥假黃單胞菌未被收錄于Vitek 2 Compact現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中，或許是導(dǎo)致鑒定錯誤的另一個重要原因。值得注意的是，梅里埃MALDI-TOF MS系統(tǒng)與Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定儀鑒定結(jié)果之間的差異需要引起實(shí)驗(yàn)室工作人員的關(guān)注。張磊等[10]和李繼霞等[11]曾報道Vitek 2 Compact可將蜃樓弗朗西斯菌、Kerstersiagyiorum、豬丹腸桿菌、關(guān)節(jié)炎放線桿菌錯誤鑒定為少動鞘氨醇單胞菌。在Vitek 2 Compact鑒定結(jié)果為少動鞘氨醇單胞菌但鑒定值較低的情況下，應(yīng)采用其他鑒定方法對鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。而當(dāng)MALDI-TOF MS系統(tǒng)與Vitek 2 Compact鑒定結(jié)果不一致時，應(yīng)選擇基因序列分析作為金標(biāo)準(zhǔn)對鑒定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。本例Vitek MS鑒定結(jié)果與16S rDNA測序結(jié)果一致，因此,使用Vitek MS對墨西哥假黃單胞菌進(jìn)行鑒定的結(jié)果可信。

正常情況下，腦組織受到頭皮、顱骨、腦膜、血腦屏障的多重保護(hù), 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染率低，但顱腦外傷或手術(shù)等侵襲性操作導(dǎo)致屏障破壞使感染風(fēng)險增大[12]，顱內(nèi)感染是神經(jīng)外科術(shù)后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[13]，早期明確感染的病原學(xué)診斷是正確抗感染治療的關(guān)鍵[14]。本例患者為開放性顱腦損傷，存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的高危因素，術(shù)后留置的頭皮下引流管及腰大肌引流管均可能引起細(xì)菌逆行導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染?；颊咝g(shù)后出現(xiàn)發(fā)熱，腦脊液常規(guī)白細(xì)胞數(shù)明顯增高并以多個核細(xì)胞為主，葡萄糖、氯降低，蛋白質(zhì)和乳酸升高，各項(xiàng)指標(biāo)均提示細(xì)菌性腦膜炎，腦脊液増菌培養(yǎng)及常規(guī)培養(yǎng)均見墨西哥假黃單胞菌生長，證實(shí)了細(xì)菌性腦膜炎的診斷。參考藥敏結(jié)果抗感染治療后，患者病情好轉(zhuǎn)，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)及各項(xiàng)指標(biāo)均呈下降趨勢，連續(xù)2次送檢腦脊液培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，顯示抗感染治療有效。

墨西哥假黃單胞菌的醫(yī)學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)及病例報道甚少，并且未見在腦脊液標(biāo)本中分離出墨西哥假黃單胞菌的相關(guān)報道。本文結(jié)合病例對該菌的形態(tài)特點(diǎn)、培養(yǎng)特性、鑒定方法、藥物敏感性進(jìn)行報告，有助于該菌致病性的研究、微生物工作人員鑒定該菌的能力提高以及感染患者的診治。