陸燕飛，劉根焰，張曉慧，許雨喬，倪芳，文怡(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部，南京210029)

血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準。在血培養(yǎng)瓶陽性報警后通常需要48～72 h才能獲得傳統(tǒng)的血培養(yǎng)細菌鑒定與藥敏試驗結(jié)果?？焖俚难囵B(yǎng)細菌鑒定、及時可靠的藥敏結(jié)果對臨床及早合理使用抗菌藥物、降低患者死亡率有重要意義。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術(shù)可直接對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進行快速鑒定且具有較高的準確性[1]。歐洲藥敏試驗委員會(EUCAST)和美國臨床和實驗室標(biāo)準化協(xié)會(CLSI)在2018年和2021年分別發(fā)布了紙片法血培養(yǎng)陽性瓶直接快速藥敏試驗(rapid antimicrobial susceptibility testing, RAST)方法[2-3]，致力于縮短血培養(yǎng)藥敏報告時間。采用EUCAST方法可在4～8 h內(nèi)獲得快速藥敏結(jié)果，而CLSI方法則需要16～18 h。本研究在MALDI-TOF MS快速鑒定的基礎(chǔ)上參考EUCAST血培養(yǎng)RAST方法對腸桿菌目細菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進行RAST，并將結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果進行對比，以期為本實驗室建立血培養(yǎng)快速鑒定及藥敏試驗方法提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1菌株來源 收集2020年4月—7月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血培養(yǎng)報陽后直接涂片為單一革蘭陰性桿菌標(biāo)本，排除3 d內(nèi)重復(fù)送檢為同一種細菌及混合感染的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 BACTEC TM FX血培養(yǎng)系統(tǒng)和血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)；Vitek MS質(zhì)譜儀、Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)及配套試劑(法國生物梅里埃公司)；血平板、巧克力平板、M-H瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)；藥敏紙片(英國Oxoid公司)；真空采血管(Greiner bio-one公司)。

1.3方法

1.3.1血培養(yǎng)陽性標(biāo)本快速鑒定及藥敏試驗

1.3.1.1Vitek MS快速鑒定 血培養(yǎng)陽性報警后，取出陽性瓶內(nèi)培養(yǎng)物進行革蘭染色，當(dāng)鏡下顯示單一革蘭陰性桿菌時，顛倒混勻血培養(yǎng)瓶，用無菌注射器抽取4 mL陽性血培養(yǎng)液至帶分離膠的真空采血管內(nèi)，室溫3 500 r/min離心10 min，棄上清液后加入1 mL無菌去離子水，混勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管內(nèi)，16 000×g離心1 min，棄上清液后加入75%乙醇混勻，16 000×g離心2 min，棄上清液，待乙醇揮發(fā)后加入20 μL無菌去離子水混勻沉淀，取0.5 μL沉淀點樣至金屬靶板，加1 μL基質(zhì)液，待靶板干燥后使用Vitek MS進行快速鑒定。

1.3.1.2陽性血培養(yǎng)液RAST 以MALDI-TOF MS快速鑒定結(jié)果為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本作為RAST的研究對象。參考2018年EUCAST公布的陽性血培養(yǎng)液RAST方法[2]，即從血培養(yǎng)瓶中直接吸取100 μL陽性培養(yǎng)液至直徑90 mm的M-H平板上，均勻涂布后貼上相應(yīng)抗菌藥物紙片，藥敏紙片包括哌拉西林/他唑巴坦(TZP，36 μg/6 μg)、頭孢噻肟(CTX，5 μg)、頭孢他啶(CAZ，10 μg)、美羅培南(MEM，10 μg)、環(huán)丙沙星(CIP，5 μg)、阿米卡星(AK，30 μg)、慶大霉素(CN，10 μg)，35 ℃溫育4 h、6 h、8 h后，分別從正面量取抑菌圈直徑，根據(jù)EUCAST指南中不同細菌在不同時間的快速藥敏折點判讀藥敏結(jié)果，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。參考EUCAST標(biāo)準，RAST藥敏結(jié)果可分為敏感、耐藥和技術(shù)不定區(qū)域(area of technical uncertainty, ATU)。ATU是細菌敏感與耐藥折點重疊的區(qū)域，抑菌圈直徑范圍通常在1～3 mm[2]，與CLSI中“中介”的概念不同。當(dāng)抑菌圈直徑落入此范圍時，其判斷為敏感、中介、耐藥的錯誤率比較高，因此對于ATU結(jié)果不提供藥敏結(jié)果的判讀[2,4]。

1.3.2血培養(yǎng)陽性標(biāo)本常規(guī)鑒定及藥敏試驗 當(dāng)血培養(yǎng)儀提示陽性報警時，取出陽性瓶進行革蘭染色并轉(zhuǎn)種至相應(yīng)平板溫育18～24 h，分離出單個菌落，制備成0.5個麥氏濁度單位菌懸液。革蘭陰性桿菌采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定分析儀配套鑒定卡及藥敏卡(AST GN09)進行菌株鑒定及藥敏，同時加做CTX(30 μg)K-B法藥敏試驗。藥敏結(jié)果按照CLSI M100-S29規(guī)定進行判讀，當(dāng)儀器顯示亞胺培南或美羅培南耐藥時經(jīng)K-B法復(fù)核后，根據(jù)CLSI定義判定為耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae bacteria，CRE)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3.3藥敏結(jié)果比較 比較RAST藥敏與常規(guī)藥敏結(jié)果的一致性，判斷標(biāo)準如下：(1)符合(categorial agreement, CA)：常規(guī)藥敏結(jié)果為敏感(或耐藥)，RAST結(jié)果為敏感(或耐藥)；(2)錯誤(error, Er)：常規(guī)藥敏結(jié)果與RAST結(jié)果不一致，包括①非常重大錯誤(very major errors, VME)：假敏感，即常規(guī)藥敏結(jié)果為耐藥，RAST結(jié)果為敏感；②重大錯誤(major errors, ME)：假耐藥，即常規(guī)藥敏結(jié)果為敏感，RAST結(jié)果為耐藥；③微小錯誤(minor errors, mE)：常規(guī)藥敏結(jié)果為中介，RAST結(jié)果為敏感或耐藥。無ATU結(jié)果的判讀及比較。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進行。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。四格表資料采用χ2檢驗進行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Vitek MS快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較分析 共有126例血培養(yǎng)陽性標(biāo)本利用Vitek MS進行快速鑒定，Vitek 2 Compact常規(guī)鑒定為腸桿菌目細菌104株和非發(fā)酵革蘭陰性桿菌22株。質(zhì)譜快速鑒定腸桿菌目細菌的檢出率為96.2%(100/104)。細菌快速鑒定結(jié)果與常規(guī)鑒定結(jié)果一致，見表1。Vitek MS快速鑒定通?？稍? h內(nèi)完成。

表1 革蘭陰性桿菌血培養(yǎng)陽性標(biāo)本Vitek MS快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較

2.2陽性血培養(yǎng)液RAST藥敏結(jié)果分析

2.2.1RAST可量取的抑菌圈直徑結(jié)果分析 共有90株腸桿菌目細菌進行血培養(yǎng)RAST，包括肺炎克雷伯菌50株和大腸埃希菌40株。腸桿菌目細菌陽性血培養(yǎng)液RAST在4 h、6 h、8 h可量取抑菌圈的比例分別為94.3%、100%、100%。見表2。

表2 細菌各時間段可量取抑菌圈直徑的比例(%)

2.2.2RAST藥敏結(jié)果判讀 在4 h、6 h、8 h判讀腸桿菌目細菌藥敏結(jié)果時，7種抗菌藥物在4 h、6 h、8 h時的RAST結(jié)果平均CA比例上升，分別為76.0%(453/596)、92.4%(551/596)、94.0%(560/596)；ATU比例下降，分別為17.8%(106/596)、7.0%(42/596)、5.7(34/596)。6 h判讀腸桿菌目細菌藥敏結(jié)果的符合率優(yōu)于4 h判讀腸桿菌目細菌藥敏結(jié)果的符合率(χ2=15.566，P<0.001)，與8 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.495，P=0.482)。4 h、6 h、8 h藥敏結(jié)果判讀時CA比例最高的抗菌藥物分別為CIP、MEM、MEM；CA比例最低的抗菌藥物分別為TZP、CAZ、CAZ。4 h、6 h、8 h藥敏結(jié)果判讀平均錯誤的比例分別為0.7%(4/596)、0.5%(3/596)、0.5%(3/596)，僅有1例肺炎克雷伯菌對CTX的藥敏結(jié)果在3個時間點判讀時均為VME，見表3。肺炎克雷伯菌在各時間段判讀的藥敏結(jié)果CA比例均高于大腸埃希菌；ATU比例均低于大腸埃希菌，其中兩者CA及ATU比例在4 h和6 h判讀時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌各判讀時間藥敏結(jié)果比較[n(%)]

2.2.3血流感染CRE時RAST藥敏結(jié)果分析及比較 共有25株CRE，在4 h、6 h、8 h 藥敏判讀時CRE檢出率分別為92.0%(23/25)、96.0%(24/25)、96.0%(24/25)，各時間段CRE檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.528，P=0.768)。CRE菌株分別在4 h、6 h、8 h判斷整體抗菌譜時，平均CA分別為96.0%(167/174)、97.7%(170/174)、98.3%(171/174)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.908，P=0.385)；平均ATU分別為3.4%(6/174)、1.7%(3/174)、1.1%(2/174)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.415，P=0.299)。見表5。

表5 CRE各時間段快速藥敏結(jié)果符合率比較(%)

3 討論

一項薈萃分析顯示，利用MALDI-TOF MS對陽性血培養(yǎng)液進行快速鑒定時，對革蘭陰性菌特別是腸桿菌目細菌具有極高的準確性，對革蘭陽性菌鑒定的準確率略低[5]。由于細菌分布及陽性血培養(yǎng)液前處理方法不同，各研究的準確率有所差異[6]。本研究126株革蘭陰性菌中121株可快速準確鑒定到種，準確率高達96.0%，且鑒定時間控制在1 h內(nèi)，為臨床早期經(jīng)驗性用藥及后續(xù)快速藥敏結(jié)果判讀提供了快速可靠的病原學(xué)依據(jù)。

陽性血培養(yǎng)液RAST近年來已成為國內(nèi)外研究的熱點[7]。目前，快速獲得血培養(yǎng)病原菌藥敏結(jié)果的方法眾多，部分研究者將陽性血培養(yǎng)液預(yù)處理后制備成0.5麥氏濁度單位的菌懸液，使用自動化儀器或紙片擴散法進行藥敏試驗[8]，此法耗時相對較長，特別是紙片擴散法仍需18～24 h，且無規(guī)范化折點來判斷藥敏結(jié)果；有學(xué)者用直接涂片檢查分析不同抗菌藥物條件下細菌形態(tài)的變化，可在6 h內(nèi)檢測細菌的耐藥性[9]，該方法較為復(fù)雜，不易常規(guī)操作；谷鈺峰等[10]利用流式細胞術(shù)對微生物的代謝參數(shù)進行檢測，可在3 h內(nèi)檢測細菌對抗菌藥物的敏感性，此法儀器價格昂貴，一般實驗室難以檢測；另外，利用分子生物學(xué)手段可以快速檢測細菌的耐藥基因[11]，但檢測價格昂貴，不易常規(guī)檢測。2018年4月EUCAST發(fā)布了陽性血培養(yǎng)液RAST及折點，該法方法簡單、成本低、耗時短，易于實驗室常規(guī)開展及標(biāo)準化，具有普遍適用性，在一定程度上可彌補上述各方法存在的缺陷，目前腸桿菌目細菌中肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌可進行RAST。

本研究在質(zhì)譜快速鑒定的基礎(chǔ)上參考EUCAST陽性血培養(yǎng)液RAST方法，分別在4 h、6 h、8 h對90例陽性血培養(yǎng)液RAST結(jié)果進行分析。研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌目細菌大部分抑菌圈直徑4 h即可量取，且肺炎克雷伯菌可量取比例高于大腸埃希菌，6 h起大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直徑即可全部測量，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[12]。細菌抑菌圈直徑量取的準確性直接影響后續(xù)藥敏結(jié)果的判讀，若出現(xiàn)細菌生長不良或抑菌圈邊緣不清時不應(yīng)量取，對于大腸埃希菌溫育早期可能存在抑菌圈內(nèi)的薄霧狀生長應(yīng)忽略[1,12]。各時間點量取的抑菌圈直徑根據(jù)EUCAST血培養(yǎng)液RAST藥敏折點進行判讀[1]，每種細菌在4 h、6 h、8 h都有獨立的折點，可分別進行藥敏分析。有文獻報道若將RAST抑菌圈直徑使用常規(guī)的藥敏折點進行判讀，結(jié)果準確性偏低[13]。

根據(jù)CLSI M52及美國FDA規(guī)定，一個可接受的藥敏系統(tǒng)必須要達到的條件包括CA≥90%、VME≤1.5%、ME≤3.0% 以及mE<10%[13-14]。本研究結(jié)果顯示，腸桿菌目細菌從6 h判讀時CA比例即>90%，與4 h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但與8 h相比無明顯差異，提示6 h判讀腸桿菌目細菌整體抗菌譜在準確性和時間上具有優(yōu)勢，Soo等[14]的研究也得出類似結(jié)論。不同抗菌藥物在不同時間點判讀時藥敏結(jié)果符合率有所差別，有文獻報道4 h判讀腸桿菌目細菌藥敏結(jié)果時，TZP和CIP分別表現(xiàn)出最低和最高的CA(60% vs 94.6%)，而當(dāng)6 h判讀時CA最低和最高的抗菌藥物則為AK和MEM(88.5% vs 98.4%)[13]。本研究4 h藥敏判讀結(jié)果與上述文獻報道一致，其中TZP僅有55.6%的RAST藥敏結(jié)果與常規(guī)相符，可能是由于此藥ATU范圍內(nèi)的抑菌圈直徑跨度較大，導(dǎo)致很大一部分藥敏結(jié)果落在ATU范圍內(nèi)，從而降低了CA的比例。MEM從6 h起即成為藥敏符合率最高的抗菌藥物，CA比例高達98.9%，僅有1株耐藥株的藥敏結(jié)果落在ATU范圍內(nèi)，可能是由于抑菌圈直徑量取誤差導(dǎo)致。肺炎克雷伯菌CA的比例普遍高于大腸埃希菌，表明此RAST針對肺炎克雷伯菌血流感染存在優(yōu)勢。

本研究中25株CRE在4 h、6 h、8 h的檢出率無明顯差異，表明CRE可提前至4 h判斷。由于CRE菌株對大多數(shù)抗菌藥物均耐藥，因此臨床更關(guān)注CRE快速藥敏結(jié)果為敏感的抗菌藥物的結(jié)果準確性， 此RAST方法中AK、CN、CIP及CAZ無判斷錯誤的情況發(fā)生，僅有1株CTX耐藥的肺炎克雷伯菌在3次藥敏判讀時均判讀為敏感，可能是由于抑菌圈直徑量取時，剛好落在敏感折點處發(fā)生錯誤，各時間段CRE藥敏CA的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，4 h即可判斷整體抗菌譜。

研究結(jié)果顯示，腸桿菌目細菌在4 h、6 h、8 h判讀時藥敏結(jié)果的錯誤比例均遠小于CLSI M52及FDA標(biāo)準，Jasuja等[15]報道TZP和CIP存在VME的情況，本研究暫未發(fā)現(xiàn)，可能與菌株數(shù)量有關(guān)，該現(xiàn)象有待進一步研究探討。 ATU是陽性血培養(yǎng)液RAST不可忽視的一部分。一般來說，溫育時間越短，ATU結(jié)果的比例越高[1,13]，本研究結(jié)果顯示腸桿菌目細菌在4 h時的ATU比例最高，6 h、8 h可從17.2%降至6.9%、5.4%。ATU區(qū)域的存在減少了假敏感和假耐藥的情況發(fā)生，降低了VME和ME的比例[15]，但同時也會降低CA的比例，過高的ATU比例可導(dǎo)致過多的藥敏結(jié)果留白，降低快速藥敏的準確性[15]，本研究中ATU比例最高的抗菌藥物其CA比例亦最低。

當(dāng)然，本研究目前仍存在一定缺陷，耐藥菌分析的數(shù)量不多，且未對非發(fā)酵菌及革蘭陽性菌快速藥敏進行評價。有關(guān)陽性血培養(yǎng)液RAST方法學(xué)，目前也仍有一些問題需要探討，如其他血培養(yǎng)常見腸桿菌目細菌是否可以進行RAST、折點如何確立；如何克服抑菌圈量取時的人工誤差；怎樣將此RAST方法流程合理化，這些問題都有待進一步研究解決。

綜上所述，腸桿菌目細菌血培養(yǎng)陽性標(biāo)本質(zhì)譜快速鑒定準確性高，參考EUCAST血培養(yǎng)RAST方法，腸桿菌目細菌血培養(yǎng)標(biāo)本快速藥敏結(jié)果與常規(guī)結(jié)果一致性好，6 h可作為腸桿菌目細菌RAST藥敏判讀的最佳時間點，4 h即可判斷是否存在CRE感染并推測其整體抗菌譜。