李婧，溫海楠，王惠，劉焱超，張盼，邢恩鴻，孫啟玉，謝守軍(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院南區(qū)檢驗(yàn)科，河北承德 067000)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii，Ab)是臨床常見的革蘭陰性條件致病菌，易引發(fā)呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的感染[1]。近年來，由于抗菌藥物的濫用，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii，MDR-AB)越來越多見，給臨床的治療帶來極大的困難。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性形成的機(jī)制復(fù)雜，其中生物膜的形成是其耐藥性增加的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌以生物膜的形式存在時(shí)，抗菌藥物很難穿透生物膜殺死其深部的細(xì)菌，從而易導(dǎo)致患者出現(xiàn)感染反復(fù)或遷延不愈的現(xiàn)象[2]。由于Ab耐藥性的日益增加，常規(guī)的治療藥物在體內(nèi)多處于亞抑菌濃度(subinhibitory concentration，sub-MIC)水平，即低于最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)而對(duì)細(xì)菌具有選擇作用的抗菌藥物濃度。sub-MIC抗菌藥物雖不能有效殺滅病原菌，卻對(duì)細(xì)菌的生理行為存在潛移默化的影響，且其對(duì)菌株生物膜的影響也因抗菌藥物和菌株種類的不同存在差異[3]。頭孢哌酮舒巴坦為國內(nèi)常用的治療Ab感染的藥物，具有較好的抗菌活性，但面對(duì)多重耐藥的菌株時(shí)還需進(jìn)行藥物的聯(lián)合使用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，舒巴坦與亞胺培南或替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以增加對(duì)MDR-AB的體外抗菌活性，但對(duì)生物膜的相關(guān)研究還未見報(bào)道[5]。故本研究擬探究sub-MIC頭孢哌酮舒巴坦與替加環(huán)素或亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)生物膜體外活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 臨床分離的MDR-AB 60株(對(duì)3類或3類以上抗菌藥物中的每類抗菌藥物至少1種藥物獲得性不敏感[6]，同時(shí)剔除分離自同一患者相同部位的重復(fù)菌株)，均由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院南院檢驗(yàn)科微生物室提供。鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606購于北納生物公司。

1.1.2主要試劑 頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：903C021；舒巴坦鈉標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：917A021；亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：924I022；替加環(huán)素，批號(hào)：608A022；LB肉湯，批號(hào)：1127L031；M-H肉湯，批號(hào)：119L031；結(jié)晶紫水溶液，批號(hào)：20210115，均購自北京索萊寶公司。培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，批號(hào)：W9202；cDNA第一鏈合成試劑盒，批號(hào)：W9209；熒光定量預(yù)混試劑，批號(hào)：U9208，均購自北京天根公司；引物由上海生工生物公司合成。

1.1.3主要儀器 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜儀、Vitek 2全自動(dòng)微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)；酶聯(lián)儀(美國Thermo公司)；熒光定量PCR儀(美國羅氏公司)。

1.2方法

1.2.1結(jié)晶紫半定量法測(cè)定目標(biāo)菌株生物膜形成能力 將收集的臨床分離菌株復(fù)蘇后接種于血平板上過夜培養(yǎng)，隔日挑取新鮮的單個(gè)菌落用生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?，再用LB肉湯以1∶100的比例將其稀釋，以每孔200 μL加入到96孔板中，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)復(fù)孔及1個(gè)不加細(xì)菌培養(yǎng)的陰性對(duì)照孔。在37 ℃溫育48 h后，棄上層培養(yǎng)液，用PBS輕柔沖洗孔壁3次，置于通風(fēng)處晾干。固定后于每孔內(nèi)加入200 μL 10 g/L結(jié)晶紫水溶液染色10 min，棄去染液后用蒸餾水沖洗3次，于通風(fēng)處晾干。每孔加入200 μL 30%冰醋酸，在結(jié)晶紫充分溶解后使用酶聯(lián)儀在590 nm處檢測(cè)其吸光度(A590 nm)。每株菌所測(cè)得的A590 nm值均值為X，陰性對(duì)照組所測(cè)A590 nm值均值為Xa，通過計(jì)算和比較，將目標(biāo)菌株生物膜形成能力分為以下4類：X≤Xa為陰性(-)，Xa4Xa為強(qiáng)陽性(+++)[7]。

1.2.2微量肉湯稀釋法測(cè)定目標(biāo)菌株MIC值 挑選生物膜形成能力較強(qiáng)(陽性和強(qiáng)陽性)的菌株，分別檢測(cè)其頭孢哌酮舒巴坦(頭孢哌酮與舒巴坦鈉的比值為2∶1)、替加環(huán)素和亞胺培南的MIC值。菌株劃線接種于血平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取單菌落將菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，后?∶100的M-H肉湯進(jìn)行稀釋，每孔加入100 μL菌液。將藥物通過M-H肉湯分別倍比稀釋為1 024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL后，再將其分別以100 μL加入相應(yīng)孔中，每株設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并記錄每孔的終濃度。37 ℃溫育24 h后，無細(xì)菌生長(zhǎng)處對(duì)應(yīng)濃度即為該菌的MIC。

1.2.3結(jié)晶紫半定量法測(cè)定sub-MIC聯(lián)合用藥后菌株生物膜形成能力 將挑選的生物膜形成能力較強(qiáng)的菌株復(fù)蘇后接種于血平板上過夜培養(yǎng)，隔日挑取新鮮的單個(gè)菌落用生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙海儆肔B肉湯以1∶100的比例將其稀釋，以每孔100 μL加入96孔板。用LB培養(yǎng)基分別將替加環(huán)素、頭孢哌酮舒巴坦和亞胺培南稀釋成0、1/8、1/4、1/2 MIC系列濃度，采用棋盤法將不同濃度的替加環(huán)素和頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南和頭孢哌酮舒巴坦分別進(jìn)行兩兩組合，再以每孔100 μL加入相應(yīng)孔中(每組設(shè)立1個(gè)不加藥物的陽性對(duì)照組)。37 ℃溫育48 h后，用結(jié)晶紫半定量法測(cè)定生物膜形成情況，每株進(jìn)行2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4熒光定量PCR測(cè)定生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)水平 選取具有代表性的5株臨床分離株A2、A5、A17、A41、A43(分別分離自尿液、痰液、導(dǎo)管尖端、膿液和膽汁)和ATCC19606進(jìn)行生物膜形成相關(guān)基因的檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)分別檢測(cè)聯(lián)合用藥前后ompA、adeG、bap和abaI基因的相對(duì)表達(dá)情況，并以16S RNA作為內(nèi)參。按照培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒的要求分別提取用藥前后細(xì)菌的總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒的說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR(引物序列見表1)。熒光定量PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模板1 μL，無酶ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，55～60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法計(jì)算目的基因的2-△△Ct值從而測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

表1 引物序列和退火溫度

2 結(jié)果

2.1MDR-AB生物膜形成能力 陰性對(duì)照組所測(cè)A590 nm值均值Xa=0.05，X>Xa即表明該菌株具有生物膜形成能力。60株MDR-AB中57株(占95%)具有生物膜形成能力。其中生物膜形成能力弱陽性(+)的有25株(占44%)，形成能力陽性(++)的有28株(占49%)，形成能力強(qiáng)陽性(+++)的有4株(占7%)。

2.2MIC的測(cè)定 替加環(huán)素對(duì)MDR-AB的MIC范圍為0.5～8 μg/mL，頭孢哌酮舒巴坦(2∶1)對(duì)MDR-AB的MIC范圍為128～256 μg/mL，亞胺培南對(duì)MDR-AB的MIC范圍為64～512 μg/mL。

2.3單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)MDR-AB生物膜的體外效果 sub-MIC下，單獨(dú)應(yīng)用頭孢哌酮舒巴坦、替加環(huán)素和亞胺培南與陽性對(duì)照組相比，A590 nm值差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

加入1/2 MIC替加環(huán)素后與單獨(dú)應(yīng)用1/8、1/4和1/2 MIC頭孢哌酮舒巴坦相比，A590 nm值顯著下降，加入1/4 MIC替加環(huán)素后與單獨(dú)應(yīng)用1/8和1/4 MIC頭孢哌酮舒巴坦相比，差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；加入1/4和1/2 MIC頭孢哌酮舒巴坦后與單獨(dú)應(yīng)用1/8、1/4和1/2 MIC替加環(huán)素相比，A590 nm值顯著下降，加入1/8 MIC頭孢哌酮舒巴坦后與單獨(dú)應(yīng)用1/8和1/4 MIC替加環(huán)素相比，差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)用替加環(huán)素對(duì)MDR-AB生物膜的作用效果

加入1/8、1/4和1/2 MIC亞胺培南后與單獨(dú)應(yīng)用1/8和1/4 MIC頭孢哌酮舒巴坦相比，A590 nm值顯著下降；加入1/2 MIC亞胺培南與單用1/2 MIC頭孢哌酮舒巴坦相比，差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；加入1/4和1/2 MIC頭孢哌酮舒巴坦后與單獨(dú)應(yīng)用1/8、1/4和1/2 MIC亞胺培南相比，A590 nm值顯著下降；加入1/8 MIC頭孢哌酮舒巴坦與單用1/8和1/4 MIC亞胺培南相比，差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)用亞胺培南對(duì)MDR-AB生物膜的作用效果

2.4生物膜相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá) 以1/4 MIC替加環(huán)素+1/4 MIC頭孢哌酮舒巴坦和1/4 MIC亞胺培南+1/4 MIC頭孢哌酮舒巴坦作用于菌株ATCC19606、A2、A5、A17、A41和A43后，對(duì)細(xì)菌生物膜均具有較好的抑制作用，故以該2種聯(lián)合用藥的濃度為代表,對(duì)其生物膜相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。在替加環(huán)素+頭孢哌酮舒巴坦的作用下，ATCC19606的ompA、adeG和bap表達(dá)水平受到顯著抑制，A2和A43的ompA、abaI、adeG和bap表達(dá)受到顯著抑制，A5的adeG和bap表達(dá)受到顯著抑制，A17和A41的abaI、adeG和bap表達(dá)受到顯著抑制(P均<0.05)；在亞胺培南+頭孢哌酮舒巴坦的作用下，ATCC19606的abaI、adeG和bap表達(dá)受到顯著抑制，A2和A43的ompA、abaI、adeG和bap表達(dá)受到顯著抑制，A5的ompA、abaI和bap表達(dá)受到顯著抑制，A17和A41的abaI、adeG和bap表達(dá)受到顯著抑制(P均<0.05)。

注：SCF，頭孢哌酮舒巴坦；IMP亞胺培南；TGC，替加環(huán)素。*，與無藥物作用的對(duì)照株相比，P<0.05。圖1 sub-MIC頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)合替加環(huán)素或亞胺培南對(duì)MDR-AB生物膜相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中95%的MDR-AB均具有形成生物膜的能力，且其中56%的菌株該能力較強(qiáng)，這與Badave等[12]的研究存在一致性，提示生物膜的形成與其耐藥性之間可能存在正相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，在MIC范圍內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用頭孢哌酮舒巴坦、替加環(huán)素和亞胺培南時(shí)，該3種藥物對(duì)MDR-AB生物膜的形成均具有一定的抑制作用，且生物膜的抑制效果與藥物濃度呈正比。對(duì)于sub-MIC亞胺培南的生物膜作用效果，本研究與國內(nèi)學(xué)者曹詩悅[13]的結(jié)果一致。但近年來也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)sub-MIC的亞胺培南可上調(diào)Ⅳ型菌毛基因的表達(dá)并誘導(dǎo)MDR-AB生物膜的形成[14]，說明sub-MIC抗菌藥物對(duì)菌株生物膜的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，還存在較多爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步的研究確認(rèn)。當(dāng)sub-MIC頭孢哌酮舒巴坦與替加環(huán)素或亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，相比于單獨(dú)的藥物應(yīng)用均具有更好的生物膜抑制效果，提示該2種藥物的聯(lián)合應(yīng)用也許可以更有效地穿透生物膜并影響生物膜形成相關(guān)的調(diào)控因子，從而使得較低濃度的藥物聯(lián)用也能有效抑制生物膜的形成，達(dá)到更好的抗菌效果。

Ab生物膜形成的機(jī)制十分復(fù)雜，與細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing，QS)、外膜蛋白、生物膜相關(guān)蛋白以及外排泵等多種因素都存在密切關(guān)系[15-18]。因此，本研究分別選擇群體感應(yīng)相關(guān)基因abaI、外膜蛋白A基因ompA、生物膜相關(guān)蛋白基因bap和外排泵相關(guān)基因adeG為代表，檢測(cè)sub-MIC頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)用替加環(huán)素或亞胺培南時(shí)是否會(huì)對(duì)上述調(diào)節(jié)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這2種方式的藥物聯(lián)合作用下，該4種基因的表達(dá)均呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)，與生物膜的減少存在顯著相關(guān)性。提示該4種調(diào)控機(jī)制可能都參與該2種聯(lián)合用藥對(duì)MDR-AB生物膜抑制的調(diào)節(jié)當(dāng)中，且abaI、ompA、bap和adeG可能是sub-MIC頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)用替加環(huán)素或亞胺培南抑制生物膜形成的作用靶點(diǎn)，但由于檢測(cè)的菌株量較少，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MDR-AB具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，sub-MIC頭孢哌酮舒巴坦與替加環(huán)素或亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)MDR-AB生物膜的形成仍具有較好的抑制作用，為臨床治療MDR-AB的相關(guān)感染提供了一定的理論依據(jù)。