楊敏，張鈞(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江省醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)檢驗(yàn)與監(jiān)測研究實(shí)驗(yàn)室, 杭州330016)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是常見的膽汁淤積性自身免疫性肝病，因機(jī)體對線粒體內(nèi)膜丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase complex, PDC)的E2亞基產(chǎn)生免疫應(yīng)答，引起肝內(nèi)中小膽管非化膿性炎癥，最終導(dǎo)致肝纖維化甚至肝衰竭。PBC患者臨床癥狀有高度異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為瘙癢、乏力、黃疸等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肝功能失代償。血清學(xué)特征為抗線粒體抗體(anti-mitochondrial Antibodies，AMA)或AMA-M2亞基陽性，同時伴有堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等指標(biāo)升高。隨著對疾病認(rèn)識不斷加深，加之自身抗體檢測技術(shù)的發(fā)展和普及，PBC總體發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。據(jù)估計(jì)每年全球至少有將近10萬人新診斷為PBC，40歲以上女性中PBC患者達(dá)1‰以上[1]。目前PBC患者極少數(shù)發(fā)展成終末期肝病，這主要得益于確診時間的提前和新型治療藥物的研發(fā)，使患者臨床癥狀得到及時、有效的控制，延緩了疾病進(jìn)展，而該病也從“原發(fā)性膽汁性肝硬化”更名為“原發(fā)性膽汁性膽管炎”[2]。由此可見，合適的診斷標(biāo)志物和風(fēng)險分層方法，對及早明確患者診斷，準(zhǔn)確評估風(fēng)險，合理判斷預(yù)后，采取相應(yīng)的干預(yù)措施，改善患者臨床結(jié)局至關(guān)重要。

1 發(fā)病機(jī)制

PBC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，普遍認(rèn)為環(huán)境因素的誘導(dǎo)、明顯的遺傳傾向性、各類非編碼RNA的調(diào)控引起的表觀遺傳學(xué)改變以及自身免疫應(yīng)答紊亂等一系列因素共同作用于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。

1.1環(huán)境、遺傳因素 特定的環(huán)境暴露(如反復(fù)感染、生物制劑應(yīng)用等)可通過打破自身耐受、分子模擬等機(jī)制誘導(dǎo)PBC的發(fā)生，如大腸埃希菌引起的尿路感染可通過細(xì)菌和人體的PDC-E2抗原間的分子模擬作用，增加機(jī)體罹患PBC的風(fēng)險[4]。全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)Ⅱ類抗原、IL-12A、IL-12RB2等基因存在PBC遺傳易感相關(guān)的多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)[5-6]。PBC全X染色體關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，OTUD5、GRIPAP1基因內(nèi)rs3027490、rs7059064位點(diǎn)與其顯著相關(guān)[7]。目前，關(guān)于PBC自身抗體的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，GWAS)研究表明，HLA Ⅱ類基因編碼的氨基酸與抗核斑點(diǎn)蛋白(speckled protein 100, sp100)抗體的產(chǎn)生有關(guān)[8]。

1.3非編碼RNA及表觀遺傳因素 Banales等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-506表達(dá)水平在PBC患者肝組織中升高，異常表達(dá)的miR-506可結(jié)合于mRNA的3′端非翻譯區(qū)并下調(diào)AE2表達(dá)；miR-506基因位于X染色體，或許也與該病女性多發(fā)有一定相關(guān)性。MicroRNA-34a通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/smad信號通路，促進(jìn)PBC患者上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及肝纖維化[13]。Wasik等[14]發(fā)現(xiàn)在AMA陰性的PBC患者中，miR-21和miR-150的表達(dá)水平上調(diào)，下游靶基因表達(dá)下調(diào)，并在肝纖維化進(jìn)展中發(fā)揮作用。筆者課題組前期通過表達(dá)譜芯片技術(shù)，初步發(fā)現(xiàn)了PBC中差異表達(dá)的lncRNA LOC441461可能通過結(jié)合多梳蛋白抑制性復(fù)合物PRC 2，下調(diào)NR4A3基因的表達(dá)，進(jìn)一步引起下游靶基因FOXP3的表達(dá)下調(diào)[15]。腺苷甲硫氨酸可通過其抗氧化作用，增加蛋白質(zhì)的谷胱甘肽化水平，降低患者體內(nèi)AMA滴度，改善肝功能生化指標(biāo)。這些發(fā)現(xiàn)也為PBC發(fā)病的分子機(jī)制提供了新的見解，并提示其潛在的治療價值[16]。

2 臨床指南與診斷標(biāo)志物

隨著新型診斷實(shí)驗(yàn)和技術(shù)的發(fā)展和對PBC致病機(jī)理認(rèn)識的加深，國內(nèi)外專家對先前的診療指南進(jìn)行了修訂(表1)。國內(nèi)指南《原發(fā)性膽汁性肝硬化(又名原發(fā)性膽汁性膽管炎)診斷和治療共識(2015)》中雖提及可將sp100、gp210抗體等作為AMA陰性PBC患者的重要診斷標(biāo)志物，但并未將二者納入最終的診斷標(biāo)準(zhǔn)中[17]。而國外2個指南《EASL Clinical Practice Guidelines: The diagnosis and management of patients with primary biliary cholangitis(2017)》和《Primary Biliary Cholangitis: 2018 Practice Guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases》則明確了這些抗體的診斷價值[18-19]。目前3個指南均不推薦對可疑PBC患者常規(guī)行肝組織活檢，除非AMA及其他PBC特異性抗核抗體陰性，且高度懷疑患者合并自身免疫性肝炎或者非酒精性肝炎。此外，歐洲和國內(nèi)的指南也明確指出，僅AMA陽性而血清肝功能及酶學(xué)指標(biāo)正常的患者，不足以診斷PBC。但臨床中經(jīng)常可見AMA陽性或呈典型PBC抗核抗體核型的患者血清ALP正常，對此類患者的管理也向目前的指南提出了一定的挑戰(zhàn)[20]。針對此類患者，建議臨床定期隨訪，動態(tài)監(jiān)測肝功能狀態(tài)[ALP、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase,GGT)、膽紅素等]并進(jìn)行評估，以便做到早診斷、早干預(yù)。

表1 國內(nèi)外PBC最新診療指南對比

近年來，許多臨床研究也發(fā)現(xiàn)了一些新的診斷標(biāo)志物。Mu等[21]運(yùn)用多重免疫分析法研究PBC患者的血清趨化因子譜，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)趨化因子水平均高于健康對照組，且在PBC進(jìn)程中不斷上升。對于AMA陰性PBC患者, 血清IL-31診斷PBC的ROC曲線下面積可達(dá)0.900，敏感性為87.5%，特異性為83.9%，且與PBC的纖維化進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)[22]。Hayashi等[23]發(fā)現(xiàn)血清中高水平的Gas6和Axl與組織學(xué)分期密切相關(guān)，Gas6/清蛋白比值和Axl/清蛋白比值在診斷晚期PBC時具有較高的ROC曲線下面積，或可作為非侵入性檢查的替代指標(biāo)。Vesterhus等[24]首次研究了PBC、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)患者的血清細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AIH和PSC相比，PBC患者絕大多數(shù)ECM標(biāo)志物表達(dá)增加，且與熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)治療反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。還有研究者利用斑點(diǎn)印跡法探索AMA亞基(PDC-E2、BCOADC-E2、OGDC-E2及天然的M2亞基nPDC)陽性個數(shù)對PBC的診斷價值，發(fā)現(xiàn)AMA亞基的個數(shù)比特異的靶抗原位點(diǎn)更有意義；與1種亞基陽性相比，2種、3種和4種亞基陽性分別使PBC優(yōu)勢比(odds ratio，OR)增加了2.05、4.63和21.53[25]?？辜禾羌っ?anti-hexokinase 1, HK1)和抗kelch樣12(anti-kelch-like 12, KLHL12)抗體已被鑒定為PBC患者的2個重要生物標(biāo)志物：AMA陽性和陰性的PBC患者中，抗HK1抗體的陽性率分別為44.7%和33.3%，而抗KLHL12抗體陽性率分別為41.2%和22.2%；這2種抗體陽性的患者血清ALP、GGT、膽紅素水平均高于陰性患者，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[26]。此外，血漿蛋白和非編碼RNA分子或許也可作為PBC診斷和分期的生物標(biāo)志物。Dong等[27]發(fā)現(xiàn)血漿S100鈣結(jié)合蛋白A6(S100 A6)、LINC00312、LINC00472在PBC中表達(dá)上調(diào)，LINC01257表達(dá)下調(diào)，這4個基因作為診斷標(biāo)志物的ROC曲線下面積分別為0.759、0.729、0.694和0.715，而作為PBC疾病分期的標(biāo)志物ROC曲線下面積分別為0.666、0.661、0.839和0.554。利用高通量凝集素微陣列芯片研究PBC患者及各種自身抗體陽性的PBC亞組之間的差異，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PBC患者血清IgG唾液酸聚糖水平升高；而在PBC亞組中，與AMA-M2陰性組相比，M2陽性PBC患者甘露糖和半乳糖水平降低；抗磷脂抗體陽性患者甘露糖水平降低；抗sp100陽性患者IgG N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖水平降低；而抗gp210陽性患者半乳糖水平升高；不同自身抗體陽性的PBC患者表現(xiàn)出不同的聚糖譜，提示糖基化水平的改變可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，也為發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物提供方向[28]。使用16S rRNA測序和核磁共振波譜法測定PBC患者糞便微生物菌群和短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，發(fā)現(xiàn)晚期患者糞乙酸和SCFAs含量較高，菌群alpha多樣性降低，Weisella增加，群落組成明顯不同，提示腸道菌群和代謝產(chǎn)物可能在PBC進(jìn)展中發(fā)揮作用[29]。

3 風(fēng)險分層與預(yù)后模型

UDCA可以改善患者的肝功能生化指標(biāo)，延緩肝纖維化進(jìn)展，是目前治療PBC的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，部分患者對UDCA的反應(yīng)卻并不理想。確定UDCA是否對患者有效非常有必要，因?yàn)橹委煹姆磻?yīng)性決定了疾病轉(zhuǎn)歸[30]。已有的幾個UDCA應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)，均是基于生化指標(biāo)的分層方法，包括：Barcelona、Paris Ⅰ、Rotterdam、Toronto和Paris Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)等(表2)。大部分方法是根據(jù)UDCA治療1年后ALP、GGT、清蛋白或膽紅素的變化進(jìn)行判斷。

表2 PBC患者對UDCA治療應(yīng)答的評價方法

2017年EASL指南闡述了PBC患者風(fēng)險分層的方法及意義，并推薦使用危險評分系統(tǒng)(如GLOBE和UK-PBC)，以確定患者未來發(fā)生晚期肝病和并發(fā)癥的風(fēng)險。2個模型均來自大樣本的隊(duì)列研究，并結(jié)合了UDCA反應(yīng)指標(biāo)和肝病分期特征，在內(nèi)部驗(yàn)證試驗(yàn)中均表現(xiàn)優(yōu)異。而最新的2項(xiàng)多中心研究通過比較Kaplan-Meier分析中的預(yù)測生存期和實(shí)際生存期，來評估Mayo風(fēng)險評分(MRS, 1989和1994)、UK-PBC評分和GLOBE評分的預(yù)后價值：共納入1 100例UDCA治療的PBC患者，1年后，UK-PBC評分的一致性統(tǒng)計(jì)量為0.74(95%CI:0.67～0.80)，MRS(1989和1994)為0.76(95%CI:0.72～0.81)，GLOBE評分為0.80(95%CI:0.76～0.84)；GLOBE評分表現(xiàn)出優(yōu)越的區(qū)分性能，但三者差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；所有PBC預(yù)后評分均顯示出對肝移植或死亡具有良好的預(yù)測準(zhǔn)確性，且明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的定性評價方法[31-32]。

Murillo Perez等[33]使用年齡(A)、膽紅素(B)和ALP(A)，開發(fā)了一種簡化的非專家級人員PBC分層工具(“ABA”)，以幫助PBC患者選擇合適的護(hù)理方法。與傳統(tǒng)應(yīng)用生化指標(biāo)進(jìn)行分層的方法比較，“ABA”更有助于年輕患者的風(fēng)險識別。一項(xiàng)來自日本的研究使用時間依賴的ROC分析比較清蛋白-膽紅素(ALBI)評分的預(yù)測性能，發(fā)現(xiàn)ALBI評分在觀察開始后2年內(nèi)ROC曲線下面積最高；超過2年，Mayo評分對死亡率和肝移植有更好的預(yù)后能力[34]。來自英國PBC隊(duì)列的靶向多重驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的PBC患者(68例)呈現(xiàn)出炎癥蛋白組，而UDCA治療患者(416例)炎癥蛋白組的規(guī)模減少。接受UDCA治療的患者差異表達(dá)的19種蛋白質(zhì)中有6種與趨化因子密切相關(guān)。使用血清CXCL11和CCL20水平作為應(yīng)答狀態(tài)的標(biāo)志物，ROC曲線下面積可達(dá)0.91(95%CI：0.83～0.91)。UDCA應(yīng)答不足的患者血清趨化因子升高，推測膽道上皮細(xì)胞釋放的趨化因子可能在高?；颊咧虏≈邪l(fā)揮重要作用，其作為識別高危患者的生物標(biāo)志物還有待前瞻性研究進(jìn)一步確認(rèn)[35]。

4 總結(jié)與展望

基于質(zhì)譜技術(shù)、芯片技術(shù)、大數(shù)據(jù)平臺和人工智能技術(shù)的應(yīng)用，以及單中心、多中心研究的發(fā)展，更多的遺傳和分子免疫學(xué)機(jī)制在PBC中被闡明，涌現(xiàn)出許多潛在的與病理生理過程密切相關(guān)的新標(biāo)志物，并納入到未來的預(yù)后評分系統(tǒng)中。與此同時，研究人員也可以運(yùn)用合適的算法，探索和挖掘目前已有的常規(guī)檢測指標(biāo)在PBC診斷和預(yù)后中的價值。早期診斷和正確的風(fēng)險分層不僅可以使低風(fēng)險的PBC患者得到更為規(guī)范的治療, 而且可根據(jù)患者的特征將高風(fēng)險者納入到相應(yīng)的臨床研究中，使他們從這些設(shè)計(jì)精良的研究中獲益。由劍橋大學(xué)與UK-PBC團(tuán)隊(duì)共同研發(fā)的評分系統(tǒng)可下載至電腦端使用，對患者進(jìn)行風(fēng)險分層、預(yù)后評估也將更加便捷。此外，機(jī)器學(xué)習(xí)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法的創(chuàng)新，也將進(jìn)一步提高預(yù)測模型的準(zhǔn)確性。這些高度優(yōu)化的模型將指導(dǎo)臨床管理，最終造福PBC患者。