王博文，李國(guó)凱，楊莉，彭凱歌，劉暢，拉姆次仁，黃英眉，馬盼盼(西藏軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心傳染病防控科，拉薩 850000)

呼吸道病毒感染是臨床常見的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率常年居高不下。西藏地區(qū)平均海拔超過4 000米，氧氣含量少，空氣濕度低，惡劣的高原氣候極易引起機(jī)體免疫力下降[1]，呼吸道感染的發(fā)病率更高。目前臨床上普遍采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)法對(duì)患者的鼻咽拭子樣本進(jìn)行核酸檢測(cè)，該方法具有高通量、高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，對(duì)呼吸道感染的病原學(xué)診斷具有重要意義[2]。部隊(duì)作為一個(gè)特殊群體，執(zhí)行任務(wù)量多，人口流動(dòng)性大，生活密集度高，呼吸道感染往往密集發(fā)病，嚴(yán)重影響戰(zhàn)斗力。西藏邊防單位醫(yī)療設(shè)施落后，絕大多數(shù)無法進(jìn)行呼吸道病原體核酸檢測(cè)，需要將樣本暫時(shí)保存并運(yùn)送至上級(jí)醫(yī)療單位進(jìn)行檢測(cè)。而西藏地域面積廣袤，地理環(huán)境復(fù)雜，樣本轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間長(zhǎng)。不同樣本保存條件對(duì)呼吸道病原體核酸檢測(cè)是否會(huì)產(chǎn)生影響，目前鮮見報(bào)道。本研究收集了12位腺病毒、支原體、甲型流感病毒或乙型流感病毒檢測(cè)陽性患者的鼻咽拭子樣本，設(shè)計(jì)不同的保存條件，對(duì)比保存前后樣本qPCR的檢測(cè)結(jié)果，為邊防官兵科學(xué)合理地進(jìn)行樣本保存和運(yùn)輸提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 收集2020年1月至2月西藏軍區(qū)總醫(yī)院就診且腺病毒、支原體、甲型流感病毒或乙型流感病毒鼻咽拭子核酸檢測(cè)陽性的患者鼻咽拭子樣本各3份，共計(jì)12份。

1.2試劑與儀器 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(TaKaRa公司)，腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒(北京金豪制藥公司)，病毒采樣管(中國(guó)友康生物公司)，Rotor Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1樣本采集 咽拭子采集：用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁取樣，將拭子頭浸入采樣液中，尾部棄去，旋緊采樣管螺旋口；鼻拭子采集：將聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出，將拭子頭浸入同一采樣管采樣液中，尾部棄去，旋緊采樣管螺旋口。

1.3.2樣本滅活溫度梯度和時(shí)間梯度設(shè)置 取上述不同的鼻咽拭子樣本，每份樣本混勻后分裝24支，每支120 μL。置于恒溫水槽和冰箱中，分別于20 ℃(室溫)、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃不同溫度條件下保存6 h、12 h、24 h、48 h、96 h和192 h。未保存樣本(0 h)和保存完畢后的樣本進(jìn)行后續(xù)核酸提取。

1.3.3核酸提取和病原體qPCR檢測(cè) 用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取核酸，每個(gè)樣本提取需100 μL采樣液，其余按照說明書操作。用腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒，在Rotor Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR試驗(yàn)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。所有檢測(cè)均需重復(fù)3次，取平均循環(huán)閾值(cycling threshold，Ct)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4核酸檢測(cè)結(jié)果判讀 樣本循環(huán)曲線為“S”形曲線才能計(jì)算Ct值。若樣本Ct≤37，結(jié)果判定為陽性；若3742，結(jié)果判定為陰性。每次qPCR共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，若樣本在50個(gè)循環(huán)內(nèi)仍未顯示“S”形曲線，則記錄樣本Ct為50.00。

2 結(jié)果

2.1患者基本信息 患者的性別、年齡、病原學(xué)診斷、核酸類型和Ct值見表1。

表1 患者基本信息

2.2不同保存時(shí)間對(duì)20 ℃(室溫)樣本qPCR結(jié)果的影響 12份20 ℃保存樣本不同保存時(shí)間處理后的qPCR結(jié)果分析見表2。對(duì)于腺病毒和支原體，與0 h結(jié)果相比，20 ℃保存6 h、12 h、24 h以內(nèi)Ct值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，保存48 h(P<0.05)、96 h(P<0.01)和192 h(P<0.001)時(shí)樣本Ct值明顯升高。對(duì)于甲型流感病毒和乙型流感病毒，20 ℃保存12 h以下不會(huì)引起樣本Ct值變化(P>0.05)，保存24 h以上均會(huì)引起樣本Ct值增大(P<0.05)。20 ℃(室溫)條件下，腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒陽性樣本隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)均會(huì)出現(xiàn)不同程度的陽性程度減弱甚至假陰性。

表2 不同保存時(shí)間對(duì)20 ℃(室溫)樣本Ct值的影響

2.3不同保存時(shí)間對(duì)4 ℃樣本qPCR結(jié)果的影響 12份4 ℃保存樣本不同保存時(shí)間處理后的qPCR結(jié)果分析見表3。對(duì)于腺病毒和支原體，4 ℃保存96 h以內(nèi)不會(huì)引起樣本Ct值變化(P>0.05)，保存192 h可引起樣本Ct值明顯升高(P<0.05)。對(duì)于甲型流感病毒和乙型流感病毒，4 ℃保存48 h以下不會(huì)引起樣本Ct值變化(P>0.05)，保存96 h(P<0.05)和192 h(P<0.01)均會(huì)引起樣本Ct值增大。4 ℃保存時(shí)，腺病毒和支原體樣本會(huì)逐漸出現(xiàn)陽性減弱，甲型流感病毒和乙型流感病毒仍會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

表3 不同保存時(shí)間對(duì)4 ℃樣本Ct值的影響

2.4不同保存時(shí)間對(duì)-20 ℃樣本qPCR結(jié)果的影響 12份-20 ℃保存樣本不同保存時(shí)間處理后的qPCR結(jié)果分析見表4。對(duì)于腺病毒和支原體，-20 ℃保存192 h以內(nèi)均不會(huì)引起樣本Ct值變化(P>0.05)。對(duì)于甲型流感病毒和乙型流感病毒，-20 ℃保存96 h以下不會(huì)引起樣本Ct值變化(P>0.05)，保存192 h會(huì)引起樣本Ct值增大(P<0.05)。-20 ℃保存時(shí)，所有樣本幾乎不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

表4 不同保存時(shí)間對(duì)-20 ℃樣本Ct值的影響

2.5不同保存時(shí)間對(duì)-80 ℃樣本qPCR結(jié)果的影響 對(duì)于腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒，與0 h樣本比較，-80 ℃保存192 h以內(nèi)樣本Ct值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。-80 ℃保存時(shí)，所有樣本的陽性程度幾乎沒有變化。

3 討論

有報(bào)道稱，80%以上的高原呼吸道疾病是由非細(xì)菌性病原體引起的，其中，腺病毒、肺炎支原體、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒較為常見[2-3]。目前，qPCR檢測(cè)已經(jīng)成為呼吸道病原學(xué)診斷的主流方法，如何能夠科學(xué)有效地進(jìn)行樣本保存和運(yùn)輸對(duì)于后續(xù)檢測(cè)至關(guān)重要。本研究中所使用的友康生物病毒保存液，在Hank′s基礎(chǔ)之上，添加HEPES等穩(wěn)定病毒成分，可在較寬的溫度范圍內(nèi)維持病毒的活性，大大降低了病毒的分解速度。即便如此，廠家推薦的樣本運(yùn)送及保存時(shí)間仍不超過48 h，無法滿足西藏邊防官兵樣本運(yùn)送的需要。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA病原體和RNA病原體在同樣的保存條件下，核酸檢測(cè)結(jié)果不盡相同。對(duì)于20 ℃保存溫度，DNA可以在24 h保持穩(wěn)定，而RNA只能保持12 h；4 ℃保存溫度可以使穩(wěn)定時(shí)間延長(zhǎng)，DNA可以在96 h內(nèi)保持穩(wěn)定，而RNA只能保持48 h；-20 ℃溫度下，DNA可以持續(xù)保持穩(wěn)定，RNA會(huì)在192 h改變；-80 ℃條件下DNA和RNA均能保持穩(wěn)定。這可能與不同核酸類型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不同有關(guān)[4]。因此，為了保證qPCR檢測(cè)的靈敏性和穩(wěn)定性，避免呼吸道病原體的漏檢誤檢，建議對(duì)于鼻咽拭子樣本的保存運(yùn)輸時(shí)，應(yīng)盡量使樣本處于低溫。目前，西藏邊防官兵進(jìn)行樣本運(yùn)送時(shí)普遍沒有改變樣本儲(chǔ)存條件的意識(shí)。很多單位仍然采用常溫運(yùn)送樣本，對(duì)呼吸道病原體篩查造成了巨大困難[3]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在拉薩附近可以保證24 h內(nèi)將樣本送達(dá)的單位，可以采用常溫運(yùn)送；需要48 h才能送達(dá)的單位，建議采用冰袋或冰盒運(yùn)送；估計(jì)48 h內(nèi)無法順利將樣本送達(dá)的單位，建議采購(gòu)干冰進(jìn)行運(yùn)送。這樣可以保證樣本的質(zhì)量，盡可能提高檢出率。

同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)研究也有一些缺陷。一方面，每種病原體樣本只有3例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能作為一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，可能無法全面體現(xiàn)不同樣本保存條件對(duì)呼吸道病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的影響。以后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，盡可能納入更多的呼吸道病原體類型和樣本數(shù)量，獲得更加可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另一方面，納入的研究對(duì)象均為陽性樣本，Ct值相對(duì)較低，樣本病毒載量較高，對(duì)于弱陽性樣本并沒有納入研究。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，弱陽性樣本可能對(duì)不同儲(chǔ)存條件更加敏感，更容易隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)生假陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下一步將重點(diǎn)對(duì)弱陽性樣本的儲(chǔ)存條件進(jìn)行深入研究。