楊 靜，李滑滑，洪 玲，沈 娜，曾奎杰，黃 力，倪小英

(1.湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410201； 2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410201)

近年來，食品安全問題受到國(guó)際社會(huì)的高度重視，國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟、美國(guó)和中國(guó)均對(duì)糧食中包括嘔吐毒素在內(nèi)的幾種主要真菌毒素規(guī)定了限量標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，對(duì)糧食檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)能力的要求也越來越高。提高檢驗(yàn)人員的檢測(cè)能力與水平，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制勢(shì)在必行[3-6]。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制活動(dòng)可分為外部質(zhì)量控制和內(nèi)部質(zhì)量控制，外部質(zhì)量控制是通過實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)實(shí)驗(yàn)、能力驗(yàn)證和測(cè)量審核來進(jìn)行，而內(nèi)部質(zhì)量控制是在相同的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下，通過人員比對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)、質(zhì)控樣品分析、校準(zhǔn)曲線核查、回收率實(shí)驗(yàn)等方法展開[7-8,10-11]。

本研究建立免疫親和層析凈化-高效液相色譜法，通過16名檢測(cè)人員對(duì)小麥中嘔吐毒素前處理過程進(jìn)行人員比對(duì)，并采用Z比分?jǐn)?shù)和雙試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)其實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制進(jìn)行評(píng)價(jià)。為本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制提供可靠的數(shù)據(jù)與依據(jù)，也可為其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制建設(shè)給予參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)計(jì)劃

按質(zhì)量控制要求制定比對(duì)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，確定比對(duì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、人員安排、質(zhì)量監(jiān)督、檢驗(yàn)依據(jù)和評(píng)價(jià)方法。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；HY-4A型調(diào)速振蕩器，常州澳華儀器有限公司；Direct-Q 8UV-R型超純水機(jī)，德國(guó)密理博公司；嘔吐毒素免疫親和柱，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：100 μg/ml，北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司；甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司；全麥粉中嘔吐毒素質(zhì)控樣品：800±120 μg/kg和1 845±277 μg/kg，國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院；全麥粉嘔吐毒素空白樣品：湖南糧食集團(tuán)倉(cāng)庫(kù)扦取制得；聚乙二醇6000：化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玻璃纖維微孔濾紙，上海興亞凈化材料廠生產(chǎn)。

1.3 試樣提取

稱取25 g試樣(精確到0.01 g)，加入5.0 g聚乙二醇，于250 ml錐形瓶中，加入100 ml 水，渦旋混勻，置調(diào)速振蕩器(200～300 r/min)劇烈振蕩20 min，分別通過快速定性濾紙、玻璃纖維微孔濾紙過濾，取上清液備用。

1.4 親和柱凈化

免疫親和柱平衡后，柱上面連接25 ml一次性注射器，準(zhǔn)確移取2.0 ml上清液，調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2滴/s的速度流出；待液體排干后，用去離子水洗滌2次，每次10 ml ；待液體排干后，上樣1 ml甲醇，流速1滴/s，收集洗脫液，并在50℃加熱條件下氮?dú)獯蹈?，然后?zhǔn)確移取1.0 ml流動(dòng)相(20%甲醇)復(fù)溶，最后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶，用于液相分析。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：80%水+20%甲醇(V/V)；流速：0.8 ml/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：50 μl；波長(zhǎng)：218 nm。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

由濃度為100 μg/ml嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的甲醇溶液定容，依次稀釋成濃度為100、250、500、1 000、2 000、5 000 ng/ml的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與評(píng)價(jià)

比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果須符合GB 5009.111—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》(第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法)中相應(yīng)方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求[9]，并以《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南CNAS—GL02:2018》和《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法GB/T 28043—2019》為依據(jù)[10-11]，利用Z比分?jǐn)?shù)作為性能統(tǒng)計(jì)量評(píng)價(jià)各參考人員的結(jié)果滿意度。

式中，xi為測(cè)定值，xpt為指定值，σpt為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差。

(1)指定值：本次比對(duì)考核采用國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，指定值xpt即為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值。

(2)能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差：采用GB/T 28043—2019中8.3的方法，并結(jié)合GB 5009.111—2016 中第二法再現(xiàn)性允許差確定。

(3)當(dāng)指定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(xpt)遠(yuǎn)大于能力驗(yàn)證中能力評(píng)定使用的標(biāo)準(zhǔn)差σpt，即u(xpt)>0.3σpt時(shí)，指定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度不能忽略，需使用校正的比分?jǐn)?shù)Z'對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。

式中，u(xpt)為包含因子k=2時(shí)指定值xpt的擴(kuò)展不確定度。

(4)Z值評(píng)價(jià)：若∣Z∣≤1，表明“優(yōu)秀”，1<∣Z∣≤2，表明“滿意”，無需采取進(jìn)一步措施；2<∣Z∣≤3，表明“有問題”，應(yīng)給予警戒信號(hào)；∣Z∣>3，表明“不滿意”，需要采取措施。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

以100 μg/ml 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋所得的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液(100～5 000 ng/ml)，在確定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(單位ng/ml)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嘔吐毒素含量在100～5 000 ng/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程：If=0.063 5×c-0.076 9，其相關(guān)系數(shù)R2為1.000 0。在空白全麥粉中添加目標(biāo)化合物，以3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)為25 μg/kg；以10倍的倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)為83 μg/kg，完全能滿足糧食中嘔吐毒素的測(cè)定需求。

2.2 準(zhǔn)確性和重復(fù)性

選取不含嘔吐毒素的全麥粉樣品進(jìn)行加標(biāo)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，樣品中添加了不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(3個(gè)濃度水平，添加量相當(dāng)于嘔吐毒素含量500、1 000、2 000 μg/kg)后，放置60 min，使待測(cè)成分與樣品基體成分相互作用達(dá)到平衡，再應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)的前處理方法進(jìn)行操作，其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表1。

表1 全麥粉中嘔吐毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

由表1可見，3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收率為90.4%～100.1%，3次重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～2.6%，符合一般痕量分析要求。

2.3 人員比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)與評(píng)價(jià)

為了開展小麥中嘔吐毒素人員比對(duì)考核項(xiàng)目，通過國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院購(gòu)得2個(gè)濃度的全麥粉嘔吐毒素質(zhì)控樣品作為本次比對(duì)樣品，將其每個(gè)濃度的樣品均勻的分裝成8份，隨機(jī)分發(fā)給16名參加本次比對(duì)的人員。在相同的實(shí)驗(yàn)室條件下，16名人員分別單獨(dú)完成前處理步驟，再由專業(yè)人員統(tǒng)一上機(jī)測(cè)定，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 全麥粉中嘔吐毒素的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

由表2可見，本次小麥中嘔吐毒素人員比對(duì)的檢測(cè)結(jié)果雙試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均≤9.4%，遠(yuǎn)低于GB 5009.111—2016 中第二法再現(xiàn)性允許差≤23%；利用Z比分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)，全部∣Z∣≤1，表明“優(yōu)秀”。這表明本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)過程是受控的、可信的、有效的，檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確的、可靠的。

2.4 實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)分析

參加本次實(shí)驗(yàn)比對(duì)的16名人員，均熟悉嘔吐毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，熟練各個(gè)樣品前處理步驟關(guān)鍵點(diǎn)，有效控制不利的影響因素，在該項(xiàng)檢測(cè)上具有一致的水平和能力。結(jié)合本次人員比對(duì)實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期從事嘔吐毒素項(xiàng)目檢測(cè)所獲經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為應(yīng)當(dāng)把握以下4個(gè)實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)：①精確稱量樣品，定量移取提取液、上親和柱的凈化液、氮吹后加入的復(fù)溶液，需準(zhǔn)確、熟練；②樣品加入提取液后，應(yīng)先小心的手動(dòng)搖晃，將錐形瓶底未與提取液互溶的固體散開，再置于調(diào)速振蕩器振蕩，確保樣品中嘔吐毒素的完全提取并釋放出來；③親和柱的操作是整個(gè)前處理的最關(guān)鍵步驟，應(yīng)保證整個(gè)操作過程連續(xù)、一氣呵成，還需要將水洗滌后的親和柱吹干與處理，避免親和柱中含水過多，稀釋加入的甲醇，影響嘔吐毒素的洗脫；④氮吹甲醇往往是最容易操作失誤的步驟，氮吹溫度、氮?dú)饬髁坎灰颂?，以免嘔吐毒素伴隨甲醇跑掉，過程應(yīng)連續(xù)操作、少接觸易吸附的塑料器材，復(fù)溶后，渦旋均勻，經(jīng)微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶。

3 結(jié)論

本次開展小麥中嘔吐毒素前處理過程人員比對(duì)實(shí)驗(yàn)，能較好的判定檢驗(yàn)人員的檢測(cè)操作能力與水平，也能加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量控制及有效監(jiān)控，提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力水平。本實(shí)驗(yàn)通過人員比對(duì)的檢測(cè)結(jié)果分析以及實(shí)驗(yàn)操作過程的觀察，發(fā)現(xiàn)影響檢測(cè)工作準(zhǔn)確性的因素有很多，要真正使實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力更上一個(gè)臺(tái)階，在同一實(shí)驗(yàn)室人員比對(duì)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，還須參加上級(jí)或外部機(jī)構(gòu)組織的實(shí)驗(yàn)室間能力驗(yàn)證活動(dòng)，才能了解自己在該檢測(cè)項(xiàng)目中的真實(shí)水平，發(fā)現(xiàn)問題，采取措施，及時(shí)糾正和整改[12]。