楊 靜，李滑滑，洪 玲，沈 娜，曾奎杰，黃 力，倪小英

(1.湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，湖南 長沙 410201； 2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410201)

近年來，食品安全問題受到國際社會的高度重視，國際食品法典委員會、歐盟、美國和中國均對糧食中包括嘔吐毒素在內(nèi)的幾種主要真菌毒素規(guī)定了限量標準[1-2]，對糧食檢驗檢測機構檢測能力的要求也越來越高。提高檢驗人員的檢測能力與水平，加強實驗室質(zhì)量控制勢在必行[3-6]。實驗室質(zhì)量控制活動可分為外部質(zhì)量控制和內(nèi)部質(zhì)量控制，外部質(zhì)量控制是通過實驗室間的比對實驗、能力驗證和測量審核來進行，而內(nèi)部質(zhì)量控制是在相同的實驗室環(huán)境條件下，通過人員比對、標準物質(zhì)檢測、質(zhì)控樣品分析、校準曲線核查、回收率實驗等方法展開[7-8,10-11]。

本研究建立免疫親和層析凈化-高效液相色譜法，通過16名檢測人員對小麥中嘔吐毒素前處理過程進行人員比對，并采用Z比分數(shù)和雙試驗相對標準偏差對其實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制進行評價。為本實驗室的質(zhì)量控制提供可靠的數(shù)據(jù)與依據(jù)，也可為其他相關實驗室的質(zhì)量控制建設給予參考。

1 材料與方法

1.1 試驗計劃

按質(zhì)量控制要求制定比對實驗計劃，確定比對實驗的時間、人員安排、質(zhì)量監(jiān)督、檢驗依據(jù)和評價方法。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；HY-4A型調(diào)速振蕩器，常州澳華儀器有限公司；Direct-Q 8UV-R型超純水機，德國密理博公司；嘔吐毒素免疫親和柱，北京華安麥科生物技術有限公司；嘔吐毒素標準物質(zhì)：100 μg/ml，北京美正檢測技術有限公司；甲醇：色譜純，德國默克公司；全麥粉中嘔吐毒素質(zhì)控樣品：800±120 μg/kg和1 845±277 μg/kg，國家糧食和物資儲備局科學研究院；全麥粉嘔吐毒素空白樣品：湖南糧食集團倉庫扦取制得；聚乙二醇6000：化學純，國藥集團化學試劑有限公司；玻璃纖維微孔濾紙，上海興亞凈化材料廠生產(chǎn)。

1.3 試樣提取

稱取25 g試樣(精確到0.01 g)，加入5.0 g聚乙二醇，于250 ml錐形瓶中，加入100 ml 水，渦旋混勻，置調(diào)速振蕩器(200～300 r/min)劇烈振蕩20 min，分別通過快速定性濾紙、玻璃纖維微孔濾紙過濾，取上清液備用。

1.4 親和柱凈化

免疫親和柱平衡后，柱上面連接25 ml一次性注射器，準確移取2.0 ml上清液，調(diào)節(jié)開關，使液體以1～2滴/s的速度流出；待液體排干后，用去離子水洗滌2次，每次10 ml ；待液體排干后，上樣1 ml甲醇，流速1滴/s，收集洗脫液，并在50℃加熱條件下氮氣吹干，然后準確移取1.0 ml流動相(20%甲醇)復溶，最后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶，用于液相分析。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：80%水+20%甲醇(V/V)；流速：0.8 ml/min；柱溫：35℃；進樣體積：50 μl；波長：218 nm。

1.6 標準溶液配制

由濃度為100 μg/ml嘔吐毒素標準溶液，加入質(zhì)量分數(shù)20%的甲醇溶液定容，依次稀釋成濃度為100、250、500、1 000、2 000、5 000 ng/ml的嘔吐毒素標準工作液。

1.7 結果統(tǒng)計與評價

比對實驗結果須符合GB 5009.111—2016 《食品安全國家標準食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》(第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法)中相應方法標準規(guī)定要求[9]，并以《能力驗證結果的統(tǒng)計處理和能力評價指南CNAS—GL02:2018》和《利用實驗室間比對進行能力驗證的統(tǒng)計方法GB/T 28043—2019》為依據(jù)[10-11]，利用Z比分數(shù)作為性能統(tǒng)計量評價各參考人員的結果滿意度。

式中，xi為測定值，xpt為指定值，σpt為能力評定標準差。

(1)指定值：本次比對考核采用國家有證標準物質(zhì)，指定值xpt即為標準物質(zhì)標準值。

(2)能力評定標準差：采用GB/T 28043—2019中8.3的方法，并結合GB 5009.111—2016 中第二法再現(xiàn)性允許差確定。

(3)當指定值的標準不確定度u(xpt)遠大于能力驗證中能力評定使用的標準差σpt，即u(xpt)>0.3σpt時，指定值的標準不確定度不能忽略，需使用校正的比分數(shù)Z'對結果進行評定。

式中，u(xpt)為包含因子k=2時指定值xpt的擴展不確定度。

(4)Z值評價：若∣Z∣≤1，表明“優(yōu)秀”，1<∣Z∣≤2，表明“滿意”，無需采取進一步措施；2<∣Z∣≤3，表明“有問題”，應給予警戒信號；∣Z∣>3，表明“不滿意”，需要采取措施。

2 結果與討論

2.1 線性關系、檢出限和定量限

以100 μg/ml 嘔吐毒素標準溶液稀釋所得的嘔吐毒素標準工作液(100～5 000 ng/ml)，在確定的色譜條件下進行測定。以峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度(單位ng/ml)為橫坐標繪制標準曲線。實驗結果表明，嘔吐毒素含量在100～5 000 ng/ml的范圍內(nèi)線性關系良好，線性方程：If=0.063 5×c-0.076 9，其相關系數(shù)R2為1.000 0。在空白全麥粉中添加目標化合物，以3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)為25 μg/kg；以10倍的倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)為83 μg/kg，完全能滿足糧食中嘔吐毒素的測定需求。

2.2 準確性和重復性

選取不含嘔吐毒素的全麥粉樣品進行加標和重復性實驗，樣品中添加了不同濃度的標準溶液(3個濃度水平，添加量相當于嘔吐毒素含量500、1 000、2 000 μg/kg)后，放置60 min，使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡，再應用本實驗的前處理方法進行操作，其回收率和相對標準偏差結果見表1。

表1 全麥粉中嘔吐毒素的加標回收率及相對標準偏差(n=3)

由表1可見，3個濃度水平加標回收率為90.4%～100.1%，3次重復測定的相對標準偏差為0.7%～2.6%，符合一般痕量分析要求。

2.3 人員比對結果統(tǒng)計與評價

為了開展小麥中嘔吐毒素人員比對考核項目，通過國家糧食和物資儲備局科學研究院購得2個濃度的全麥粉嘔吐毒素質(zhì)控樣品作為本次比對樣品，將其每個濃度的樣品均勻的分裝成8份，隨機分發(fā)給16名參加本次比對的人員。在相同的實驗室條件下，16名人員分別單獨完成前處理步驟，再由專業(yè)人員統(tǒng)一上機測定，其統(tǒng)計結果見表2。

表2 全麥粉中嘔吐毒素的檢測結果統(tǒng)計表

由表2可見，本次小麥中嘔吐毒素人員比對的檢測結果雙試驗相對標準偏差(RSD)均≤9.4%，遠低于GB 5009.111—2016 中第二法再現(xiàn)性允許差≤23%；利用Z比分數(shù)評價，全部∣Z∣≤1，表明“優(yōu)秀”。這表明本實驗室的檢測過程是受控的、可信的、有效的，檢測結果是準確的、可靠的。

2.4 實驗操作關鍵點分析

參加本次實驗比對的16名人員，均熟悉嘔吐毒素檢測標準內(nèi)容，熟練各個樣品前處理步驟關鍵點，有效控制不利的影響因素，在該項檢測上具有一致的水平和能力。結合本次人員比對實驗和長期從事嘔吐毒素項目檢測所獲經(jīng)驗，認為應當把握以下4個實驗操作關鍵點：①精確稱量樣品，定量移取提取液、上親和柱的凈化液、氮吹后加入的復溶液，需準確、熟練；②樣品加入提取液后，應先小心的手動搖晃，將錐形瓶底未與提取液互溶的固體散開，再置于調(diào)速振蕩器振蕩，確保樣品中嘔吐毒素的完全提取并釋放出來；③親和柱的操作是整個前處理的最關鍵步驟，應保證整個操作過程連續(xù)、一氣呵成，還需要將水洗滌后的親和柱吹干與處理，避免親和柱中含水過多，稀釋加入的甲醇，影響嘔吐毒素的洗脫；④氮吹甲醇往往是最容易操作失誤的步驟，氮吹溫度、氮氣流量不宜太高，以免嘔吐毒素伴隨甲醇跑掉，過程應連續(xù)操作、少接觸易吸附的塑料器材，復溶后，渦旋均勻，經(jīng)微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶。

3 結論

本次開展小麥中嘔吐毒素前處理過程人員比對實驗，能較好的判定檢驗人員的檢測操作能力與水平，也能加強實驗室對檢測結果的質(zhì)量控制及有效監(jiān)控，提升實驗室檢測能力水平。本實驗通過人員比對的檢測結果分析以及實驗操作過程的觀察，發(fā)現(xiàn)影響檢測工作準確性的因素有很多，要真正使實驗室的檢測能力更上一個臺階，在同一實驗室人員比對實驗的基礎上，還須參加上級或外部機構組織的實驗室間能力驗證活動，才能了解自己在該檢測項目中的真實水平，發(fā)現(xiàn)問題，采取措施，及時糾正和整改[12]。