韓勁松 姜崇發(fā) 李印玉 侯俊鋒 謝宏偉 李治松

（1 周口市中心醫(yī)院麻醉科,河南 周口 466000;2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科）

腦膠質(zhì)瘤是常見的腦原發(fā)性惡性腫瘤，其惡性程度高，侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)，手術(shù)結(jié)合放化療、分子靶向治療等綜合治療手段能有效降低腫瘤復(fù)發(fā)，提升患者生存率〔1〕。麻醉藥是手術(shù)中常用藥物，研究麻醉藥對膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，并闡明其可能的機(jī)制，可為合理應(yīng)用麻醉藥及改善患者預(yù)后提供新思路〔2〕。七氟烷是一種新型吸入麻醉藥，理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有平穩(wěn)誘導(dǎo)、蘇醒快、有一定的肌松作用等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床麻醉〔3〕。七氟烷可抑制人乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 表達(dá)有關(guān)〔4〕。七氟烷能抑制人肺腺癌A549 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)A549 細(xì)胞對順鉑的敏感性，還通過下調(diào)MMP-2、MMP-9 抑制A549 細(xì)胞的侵襲、遷移〔5〕。用七氟烷麻醉患者含藥血清處理人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44，可抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力〔6〕。但七氟烷影響人腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的機(jī)制還尚不清楚。微小RNA（miRNA）可以通過調(diào)控靶基因表達(dá)影響腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p 過表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8〕。miR-139-5p 還可通過與E26 轉(zhuǎn)錄因子（ETS1）相互作用抑制肝細(xì)胞癌的增殖，遷移和侵襲〔9〕。神經(jīng)元五聚蛋白（NPTX）1 定位于染色體17q25.3，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過程，NPTX1 在結(jié)腸癌中下調(diào)表達(dá)，NPTX1 過表達(dá)通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白A2 和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）2 表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖〔10〕。NPTX1 還是腦缺氧缺血性損傷的新型介質(zhì)，與缺氧神經(jīng)元損傷相關(guān)〔11〕。但NPTX1 對腦膠質(zhì)瘤的影響及七氟烷是否通過miR-139-5p 和NPTX1 影響腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為還尚不清楚。本實驗研究七氟烷是否通過miR-139-5p 和NPTX1 影響腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172 購自美國ATCC 庫；DMEM 培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒購自美國Sigma 公司；七氟烷購自日本Maruishi Pharmaceutical 公司；Transwell 小室、基質(zhì)膠購自美國BD 公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen 公司；蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京Solarbio 公司。anti-miR-con、antimiR-139-5p、miR-con、miR-139-5p、pcDNA 和pcDNA-NPTX1 載體質(zhì)粒由上海伯易生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將細(xì)胞A172 分別在通入1.25%、2.50%、5.00% 的七氟烷和5% CO2+95%O2的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，氣流量均為1 L/min，作為七氟烷處理組分別記為Sevoflurane 1.25%、2.50%、5.00% 組，對照（NC）組只通入5% CO2+95% O2。將pcDNA 和pcDNA-NPTX1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A172 細(xì)胞中再用5.00%的七氟烷處理，分別記為Sevoflurane+pcDNA 組、Sevoflurane+pcDNANPTX1 組。

1.3 MTT 檢測細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，按試劑盒說明操作加入MTT 試劑，酶標(biāo)儀檢測490 nm 的吸光度（OD）值。計算細(xì)胞存活率=實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.4 Transwell 檢測細(xì)胞遷移和侵襲 遷移:取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室上室，下室加含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，分別經(jīng)多聚甲醛固、0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)。侵襲:用基質(zhì)膠包被Transwell 上室，風(fēng)干后按照遷移實驗步驟操作。

1.5 Western 印跡檢測MMP-9、MMP-2、NPTX1、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，定量后上樣并進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，封閉后加入一抗4℃孵育過夜；再加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度值，計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-139-5p 和NPTX1 mRNA 表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒配制反應(yīng)體系，miR-139-5p 和NPTX1 分別以U6 和β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.7 熒光素酶報告實驗檢測miR-139-5p 和NPTX1的靶向關(guān)系 構(gòu)建NPTX1 野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-NPTX1 和MUT-NPTX1，將其分別與miR-con 和miR-139-5p 共轉(zhuǎn)染至A172 細(xì)胞中，按照說明書操作檢測熒光活性。將anti-miR-con、antimiR-139-5p、miR-con、miR-139-5p 分別轉(zhuǎn)染至A172細(xì)胞中，Western 印跡檢測NPTX1 蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 與NC 組相比，不同濃度七氟烷處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h、72 h后，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 七氟烷對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(,n=9)

表1 七氟烷對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(,n=9)

與NC 組比較:1）P＜0.05；表2 同

2.2 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與NC組相比，不同濃度七氟烷組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，MMP-9、MMP-2 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見表1、圖1、圖2。

圖1 Transwell 檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

圖2 Western 印跡檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)

2.3 不同濃度七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影響 與NC 組相比，不同濃度七氟烷組miR-139-5p 表達(dá)水平顯著升高，NPTX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見圖3，表2。

圖3 Western 印跡檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞NPTX1 的表達(dá)

表2 不同濃度七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影響(,n=9)

表2 不同濃度七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影響(,n=9)

2.4 miR-139-5p 靶向調(diào)控NPTX1 表達(dá) starBase預(yù)測到NPTX1 與miR-139-5p 存在結(jié)合位點（圖4）。miR-139-5p 與WT-NPTX1 共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05，表3）。miR-139-5p 組NPTX1 表達(dá)水平顯著低于miR-con 組（0.21 ±0.03 vs 0.66±0.05；P＜0.05）；anti-miR-139-5p 組NPTX1 表達(dá)水平顯著高于anti-miR-con 組（1.17±0.13 vs 0.71±0.07，P＜0.05）。見圖5。

圖4 miR-139-5p 與NPTX1 存在靶向序列

圖5 miR-139-5p 調(diào)控NPTX1 蛋白表達(dá)

表3 熒光素酶活性(,n=9)

表3 熒光素酶活性(,n=9)

2.5 過表達(dá)NPTX1 逆轉(zhuǎn)了七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的調(diào)控作用 與NC 組相比，Sevoflurane 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性和遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，NPTX1、MMP-9、MMP-2 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與Sevoflurane+pcDNA 組相比，Sevoflurane+pcDNA-NPTX1 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性和遷移和侵襲數(shù)量顯著升高，NPTX1、MMP-9、MMP-2 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖6、表4。

圖6 Western 印跡檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞NPTX1、MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)

表4 過表達(dá)NPTX1 逆轉(zhuǎn)了七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的調(diào)控作用(,n=9)

表4 過表達(dá)NPTX1 逆轉(zhuǎn)了七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的調(diào)控作用(,n=9)

與NC 組比較:1）P＜0.05；與Sevoflurane+pcDNA 組比較:2）P＜0.05；下表同

2.6 過表達(dá)NPTX1 逆轉(zhuǎn)了七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的抑制作用 與Sevoflurane+pcDNA 組相比，Sevoflurane+pcDNA-NPTX1 組E-cadherin 表達(dá)水平顯著降低，Vimentin、N-cadherin 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖7，表5。

圖7 Western 印跡檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 的表達(dá)

表5 過表達(dá)NPTX1 和七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的影響(,n=9)

表5 過表達(dá)NPTX1 和七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的影響(,n=9)

3 討論

七氟烷作為一種麻醉藥，其麻醉深度易調(diào)節(jié)、對循環(huán)抑制輕、呼吸道刺激小，有良好可控性，且有研究發(fā)現(xiàn)其對腦有一定的保護(hù)作用〔12，13〕。七氟烷可抑制低氧誘導(dǎo)的小鼠肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力〔14〕。七氟烷通過調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路影響MMP-2、MMP-9 蛋白水平，從而抑制乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞的侵襲、遷移能力〔15〕。七氟烷可通過下調(diào)MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞的遷移和侵襲〔16〕。本實驗中七氟烷處理A172 細(xì)胞后，MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin 表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin 表達(dá)水平顯著升高。MMP-2、MMP-9 屬于MMPs 家族，與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)，Vimentin、N-cadherin、E-cadherin均是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的相關(guān)生物標(biāo)志物，Vimentin、N-cadherin 低表達(dá)、E-cadherin 高表達(dá)抑制EMT〔17〕。說明七氟烷可能通過調(diào)控EMT 影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲。且有報道顯示七氟烷可促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172 對替莫唑胺的敏感性〔18〕。本實驗結(jié)果顯示，七氟烷處理A172 細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著降低，遷移和侵襲數(shù)量顯著降低。說明七氟烷可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。研究報道m(xù)iR-139-5p 可通過調(diào)節(jié)Flt1 介導(dǎo)的Wnt/β-catenin通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT〔19〕。miR-139-5p 能通過靶向Notch1 抑制膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移和EMT〔20〕。NPTX1 是一種分泌蛋白，在人類多能干細(xì)胞（hPSCs）的神經(jīng)誘導(dǎo)中迅速上調(diào)〔21〕。NPTX1 高甲基化與肺癌總體生存率差相關(guān)〔22〕。miR-128-3p通過靶向NPTX1 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖〔23〕。本實驗結(jié)果顯示，此外，七氟烷處理A172 細(xì)胞后，miR-139-5p 表達(dá)水平顯著升高，NPTX1 表達(dá)水平顯著降低。miR-139-5p 可靶向調(diào)控NPTX1，過表達(dá)NPTX1 逆轉(zhuǎn)了七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。

綜上所述，七氟烷可通過調(diào)控miR-139-5p/NPTX1 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT。