任麗玨 魏翠英 魏楓 張永紅 張悅

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,內(nèi)蒙古 包頭 014010）

足細(xì)胞是位于腎小球基底膜（GBM）外側(cè)的高度分化的細(xì)胞，與GBM、內(nèi)皮細(xì)胞共同組成了腎小球濾過膜，足細(xì)胞損傷是介導(dǎo)腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，以足細(xì)胞損傷為靶點的治療現(xiàn)已成為糖尿病腎病等腎小球疾病治療的新手段〔1，2〕。高血糖可以引起足細(xì)胞凋亡、脫落、數(shù)量減少，造成足細(xì)胞損傷，從而引起大量尿蛋白，啟動腎小球硬化〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（LncRNA）與腎臟發(fā)育和腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，研究其影響腎臟疾病發(fā)病和進(jìn)展機制，為腎臟疾病提供診斷依據(jù)和潛在治療靶點〔4〕。牛磺酸上調(diào)基因（TUG）1 在各種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，LncRNA TUG1 可能作為癌癥患者的有用預(yù)后生物標(biāo)志物〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn)TUG1 在足細(xì)胞中調(diào)節(jié)線粒體功能，抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積累〔6〕。TUG1 可通過下調(diào)抑癌基因P27 表達(dá)促進(jìn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌生長，而沉默TUG1 可抑制細(xì)胞增殖并上調(diào)凋亡細(xì)胞比例〔7〕。此外，微小RNA（miRNA）可通過調(diào)控足細(xì)胞在腎小球疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步研究miRNA 在足細(xì)胞及腎小球疾病中的作用有助于實現(xiàn)腎小球疾病的早診斷、早治療〔8〕。研究報道過表達(dá)miR-29a 通過抑制第10 染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因（PTEN）的表達(dá)從而抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡〔9〕。miR-29a-3p 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖而促進(jìn)其凋亡〔10〕。而TUG1 和miR-29a-3p 對高糖誘導(dǎo)的人足細(xì)胞損傷的影響及TUG1是否通過miR-29a-3p 影響足細(xì)胞損傷還尚未清楚。本實驗旨在研究TUG1 是否通過miR-29a-3p 影響高糖誘導(dǎo)的人足細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球足細(xì)胞（HPCs）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM-F12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Sigma 公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen 公司；Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio 公司；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將HPCs 細(xì)胞在37℃、含10%胎牛血清的DMEM-F12 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每隔2～3 d 傳代1 次，將融和至80%的細(xì)胞無血清饑餓培養(yǎng)24 h，用終濃度為30 mmol/L 的D-葡萄糖溶液刺激培養(yǎng)細(xì)胞48 h 作為高糖（HG）組，同時以終濃度為5 mmol/L 的D-葡萄糖溶液處理細(xì)胞作為正常對照（Control）組。將pCDH-NC、pCDH-TUG1、si-NC、si-TUG1 分別轉(zhuǎn)染至正常HPCs 細(xì)胞中，記為pCDH-NC 組，pCDH-TUG1 組、si-NC 組、si-TUG1 組。將pCDH-NC、pCDH-TUG1、anti-NC、anti-miR-29a-3p轉(zhuǎn)染至高糖處理的HPCs 細(xì)胞中，記為HG+pCDHNC 組、HG+pCDH-TUG1 組、HG+anti-NC 組和HG+anti-miR-29a-3p 組。將 pCDH-TUG1 與 miR-NC、miR-29a-3p 分別共同轉(zhuǎn)染至高糖處理的HPCs 細(xì)胞中，記為HG+pCDH-TUG1+miR-NC 組、HG+pCDHTUG1+miR-29a-3p 組；轉(zhuǎn)染均采用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒。

1.3 qRT-PCR 檢測miR-29a-3p 和TUG1 mRNA 的表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA 純度和濃度。使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3 次，循環(huán)條件為95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40 個循環(huán)；72℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.4 Western 印跡檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解，4℃，10 340 r/min 離心15 min，收集蛋白上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5 %脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗（1 ∶1 000），4℃孵育過夜，TBST 洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin 條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個蛋白樣品重復(fù)3 次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2 次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm 和發(fā)射波長530 nm 處的熒光強度。實驗重復(fù)3 次。

1.6 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測TUG1 對miR-29a-3p 的靶向調(diào)控 TargetScan 數(shù)據(jù)庫顯示TUG1 3＇UTR 區(qū)域有miR-29a-3p 結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點TUG1 3＇UTR 熒光素酶表達(dá)載體（TUG1-WT 和TUG1-MUT），用LipofectamineTM2000 將TUG1-WT 和TUG1-MUT 分別與miR-NC 和miR-29a-3p 共轉(zhuǎn)染至HPCs 細(xì)胞中。按說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗。結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla 活性比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高糖對HPCs 細(xì)胞損傷的影響 與Control 組相比，HG 組podocin、nephrin、Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低；Bax 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；HPCs 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見圖1，表1。

圖1 高糖對HPCs 細(xì)胞損傷的影響

表1 高糖對HPCs 細(xì)胞損傷及TUG1、miR-29a-3p 表達(dá)的影響(,n=9)

表1 高糖對HPCs 細(xì)胞損傷及TUG1、miR-29a-3p 表達(dá)的影響(,n=9)

與Control 組比較:1）P＜0.05

2.2 高糖處理后HPCs 細(xì)胞中LncRNA-TUG1 和miR-29a-3p 表達(dá)量 與Control 組相比，HG 組HPCs細(xì)胞中TUG1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低；miR-29a-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見表1。說明高糖可促進(jìn)miR-29a-3p 表達(dá)，抑制TUG1 mRNA 表達(dá)。

2.3 過表達(dá)TUG1 對高糖誘導(dǎo)的HPCs 細(xì)胞損傷的影響 與HG+pCDH-NC 組相比，HG+pCDH-TUG1組HPCs 細(xì)胞中podocin、nephrin、Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高；Bax、miR-29a-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；HPCs 細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖2，表2。說明過表達(dá)TUG1 抑制HPCs 細(xì)胞凋亡，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

圖2 過表達(dá)TUG1 后HPCs 細(xì)胞蛋白的表達(dá)

表2 過表達(dá)TUG1 對HPCs 細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

表2 過表達(dá)TUG1 對HPCs 細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

與HG+pCDH-NC 組比較:1）P＜0.05

2.4 抑制miR-29a-3p 的表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HPCs細(xì)胞損傷的影響 與HG+anti-NC 組相比，HG+antimiR-29a-3p 組HPCs 細(xì)胞中podocin、nephrin、Bcl-2表達(dá)水平顯著升高；Bax、miR-29a-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；HPCs 細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖3，表3。說明抑制miR-29a-3p 的表達(dá)抑制HPCs 細(xì)胞凋亡，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

圖3 抑制miR-29a-3p 后HPCs 細(xì)胞蛋白的表達(dá)

表3 抑制miR-29a-3p 后對人足細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

表3 抑制miR-29a-3p 后對人足細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

與HG+anti-NC 組比較:1）P＜0.05

2.5 LncRNA-TUG1 靶向調(diào)控miR-29a-3p TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到TUG1 與miR-29a-3p 存在結(jié)合位點（圖4）。轉(zhuǎn)染野生型和突變型表達(dá)載體TUG1-WT 和TUG1-MUT 后，相較于miR-NC 組，miR-29a-3p 組TUG1-WT 人足細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而TUG1-MUT 人足細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著（表4）。相較于pCDH-NC組，pCDH-TUG1 組miR-29a-3p 表達(dá)水平顯著降低（0.59±0.07 vs 0.20±0.03）；相較于si-NC 組，si-TUG1 組miR-29a-3p 表達(dá)水平顯著升高（0.57±0.04 vs 0.85±0.09；P＜0.05）?？梢?，TUG1 可靶向調(diào)控miR-29a-3p。

圖4 LncRNA-TUG1 靶向調(diào)控miR-29a-3p

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

與miR-NC 組比較:1）P＜0.05

2.6 過表達(dá)miR-29a-3p 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)TUG1對高糖誘導(dǎo)的人足細(xì)胞損傷的抑制作用 結(jié)果如圖5、表5 所示，與HG+pCDH-NC 組相比，HG+pCDHTUG1 組podocin、nephrin、Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高，Bax、miR-29a-3p 表達(dá)水 平顯著降低（P＜0.05）；HPCs 細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。與HG+pCDH-TUG1 +miR-NC 組相比，HG+pCDHTUG1+miR-29a-3p 組HPCs 細(xì)胞中podocin、nephrin、Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，Bax、miR-29a-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；HPCs 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

圖5 人足細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)

表5 過表達(dá)miR-29a-3p 對人足細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

表5 過表達(dá)miR-29a-3p 對人足細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

與HG+pCDH-NC 組比較:1）P＜0.05；與HG+pCDH-TUG1+miR-NC 組比較:2）P＜0.05

3 討論

足細(xì)胞是腎小球終末分化細(xì)胞，易損傷，難再生，其損傷導(dǎo)致的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常改變是腎小球疾病相關(guān)的足細(xì)胞病的主要特點〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA TUG1 在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其主要通過競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）模式與轉(zhuǎn)錄因子競爭性結(jié)合miRNA、調(diào)控下游蛋白表達(dá)等途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔12〕。TUG1 通過下調(diào)miR-29b 抑制脂多糖引起的H9c2 細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)〔13〕。TUG1 通過調(diào)節(jié)miR-223 保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷〔14〕。TUG1 過表達(dá)通過抑制細(xì)胞凋亡和炎癥來防止冷誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷〔15〕。足細(xì)胞裂孔蛋白podocin 和nephrin 是腎小球濾過分子篩的重要組成成分，在足細(xì)胞損傷時會代償性增高〔16〕。而B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcl）-2 和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）是調(diào)控凋亡關(guān)鍵因子，Bax/Bcl-2 比列升高促進(jìn)凋亡。所以，本實驗結(jié)果表明過表達(dá)TUG1 可保護(hù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)TUG1 靶向調(diào)控miR-29a-3p。有報道顯示TUG1 通過調(diào)節(jié)miR-29b 參與肝纖維化和肝星狀細(xì)胞的活化〔17〕；TUG1 通過抑制miR-29b-3p 促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的增殖和抑制細(xì)胞凋亡〔18〕。抑制miR-29a-3p 表達(dá)通過靶向上調(diào)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）7、caspase8、Bcl-2 促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡〔19〕。miR-29a-3p 抑制表達(dá)能增強喉癌Hep-2 細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡〔20〕。以上研究結(jié)果說明miR-29a-3p 影響細(xì)胞的增殖和凋亡，而TUG1 與miR-29 存在靶向調(diào)控關(guān)系。且還有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a 和miR-29b 與2 型糖尿病患者的尿白蛋白相關(guān)〔21〕。本實驗研究結(jié)果顯示，高糖處理的HPCs 中miR-29a-3p 表達(dá)水平升高，抑制miR-29a-3p 表達(dá)可提高podocin、nephrin、Bcl-2 的表達(dá)水平，降低Bax 的表達(dá)水平；降低細(xì)胞凋亡率，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。且過表達(dá)miR-29a-3p 能逆轉(zhuǎn)TUG1 過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。進(jìn)一步表明TUG1 可能通過調(diào)控miR-29a-3p 保護(hù)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷。

綜上所述，TUG1 對高糖刺激的人足細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機制可能與miR-29a-3p 表達(dá)相關(guān)。將可為糖尿病腎病等腎小球相關(guān)疾病的診斷和治療提供新靶點和理論依據(jù)。