張茂 康學(xué)棟 劉穎 朱鴻浩

（1 宜賓市第一人民醫(yī)院藥劑科,四川 宜賓 644000;2 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科）

肺氣腫是慢性阻塞性肺疾病的晚期表現(xiàn)，并無特效治療方法，故嚴(yán)重威脅人們的生命安全〔1，2〕。臨床上多以低流量吸氧、中藥治療、激素注射或者抗感染等針對其癥狀緩解的治療方法為主〔3〕。然而因肺氣腫引發(fā)的肺部組織結(jié)構(gòu)損傷和功能下降，目前的治療手段并無良好的效果。干細胞是一類可以高度增殖并具有極佳的分化分泌功能的多向性分化細胞，其在組織損傷修復(fù)方面表現(xiàn)良好〔4～6〕。其中骨髓間充質(zhì)干細胞和胎肝干細胞等由于來源受限且具有倫理學(xué)的爭議，研究受到限制。而尿液干細胞來源廣泛且無此爭議，因此其研究廣泛而深入〔7，8〕。研究顯示尿液干細胞可以修復(fù)表皮、臟器等組織損傷，其是一種未來治療組織損傷的明星細胞〔9，10〕。王晨等〔11〕研究表明，尿液細胞來源的人類誘導(dǎo)多功能干細胞可以向肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化，具有修復(fù)肺臟損傷的潛力。右美托咪定是臨床上較為常用的麻醉藥物，其是高選擇性的α2 腎上腺素受體激動劑〔12〕；其可以通過激動α2 腎上腺素受體，對患者發(fā)揮鎮(zhèn)痛和抑制焦慮的作用〔13〕。右美托咪定在緩解患者的病痛過程，其并無抑制呼吸的作用，這促使其可以廣泛應(yīng)用于肺部疾病的治療，同時趙津津等〔14〕研究表明右美托咪定通過抑制肺損傷引起的核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB、轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）-3 通路的激活進而抑制炎癥反應(yīng)最終起到肺保護作用，故其對肺氣腫有保護作用。然而目前的研究就右美托咪定聯(lián)合尿液干細胞移植對肺氣腫的影響研究較少；本研究旨在探討右美托咪定對尿液干細胞移植治療肺氣腫模型大鼠的影響。

1 實驗及材料

1.1 材料及來源 L-DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自Hyclone 公司；Trizol 試劑盒購自Invitrogen 公司；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及胰島素樣生長因子（IGF）-Ⅰ兔IgG 多克隆抗體均購自Santa anta Gruz公司；兔抗大鼠多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購自英國Abcam 公司；胰蛋白酶、RT-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；本實驗所用引物均由Invitrogen 公司合成提供。鹽酸右美托咪定注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)）；68 只體重為180～210 g 的成年雌性Wistar 大鼠（7 周齡）由北京維通利華動物實驗技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK（川）2014-0021，實驗動物使用許可證號:SYXK（川）2015-0023）2014-0012。所有Wistar 大鼠飼養(yǎng)于室溫25℃，濕度60%～70%的SPF 環(huán)境下，同時給予大鼠以自由方便的飲水和采食。人尿液干細胞購自上海通派生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 尿液干細胞培養(yǎng)和標(biāo)記 取出液氮保存的人尿液干細胞，復(fù)蘇接種于一次性細胞培養(yǎng)瓶（25 cm2）中，加入DMEM 培養(yǎng)液5 ml，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)5%CO2培養(yǎng)，每隔2 d 換液1 次。連續(xù)傳代3 次后，離心去掉上清，將尿液干細胞密度調(diào)整為1×106/ml。將細胞放置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，用PBS 洗滌細胞3 次后棄去上清液。隨后行干細胞進CFSE 的熒光標(biāo)記。向細胞懸液中加入CFSE，DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整其濃度5 μmol/L，隨后將標(biāo)記的細胞不斷搖勻轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置15 min，在熒光顯微鏡下觀測CFSE 標(biāo)記的尿液干細胞的細胞形態(tài)。

1.2.2 動物模型建立和實驗分組 68 只Wistar 雌性大鼠給予刺激處理以構(gòu)建肺氣腫模型，其處理操作如下:將大鼠放置在60 L 封閉玻璃箱中，并在玻璃箱中放入16 支點燃的香煙給予大鼠煙熏30 min，2 次/d，每次間隔6 h。在處理1 個月后麻醉大鼠，采用氣管插管向大鼠氣管中滴入豬胰彈生蛋白酶；隨后采用小動物呼吸機給予大鼠通氣并將大鼠直立旋轉(zhuǎn)使豬胰彈生蛋白酶均勻進入大鼠兩側(cè)的肺組織。隨后拔出大鼠的插管，繼續(xù)給予所有大鼠以煙熏處理，連續(xù)進行2 個月從而構(gòu)建大鼠肺氣腫模型。造模完成后隨機取8 只大鼠，取肺組織行蘇木素-伊紅（HE）染色可見建模成功。60 只大鼠隨機分為4個，每組20 只:給予病理對照組0.5 ml 的L-DMEM完全培養(yǎng)液尾靜脈注射，給予尿液干細胞組0.5 ml的5×106個/L 的尿液干細胞尾靜脈移植，給予右美托咪定組大鼠尾靜脈6 h 持續(xù)輸入5 μg/（kg·h）的右美托咪定，給予聯(lián)合治療組大鼠尾靜脈注射尿液干細 胞〔0.5 ml，5 × 106個/L〕 和右美 托咪定〔5 mg（kg·h），6 h/d〕。所有操作連續(xù)進行3 d。

1.2.3 肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達水平 治療6 w 后，從4 組中隨機選出5 只大鼠收集其肺泡灌洗液；將大鼠的肺臟舌葉作為灌洗部位以獲取BALF 細胞，所有操作參照BALF 相關(guān)的指針進行。收集4 組肺泡灌洗液后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各組肺泡灌洗液中TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達水平并進行比較。

1.2.4 肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達水平 治療6 w 后，從4 組中分別隨機選出5 只大鼠采集大鼠的肺臟50 mg，RT-PCR 檢測大鼠肺臟組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達水平。將冷凍的肺臟組織進行冰凍研磨后向組織液中加入Trizol 試劑裂解細胞并提取細胞中RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說明合成并擴增相應(yīng)cDNA。擴增條件均為94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共33 個循環(huán)。TGF-β1:上游引物:5＇-GCTAATGGTGGACCGCAAC-3＇；下游引 物:5＇-GCTAATGGTGGACCGCAAC-3＇ ；IGF-Ⅰ:上游引游5＇-GCATTGTGGATGAGTGTTGC-3＇；下游引物:5＇-GGCTCCTCCTACATTCTGTA-3＇；VEGF:上游引 物:5＇-GCTATTGCCGTCCAATTGAG-3；下游引物:5＇-GGTTTGATCCGCATGATCTG-3＇；β-actin:上游引 物:5＇-CTGCCGCATCCTCTTCCTC-3＇ ；下游引物:5＇-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3＇ 。以β-actin 基因作為內(nèi)參，測定4 組IGF-ⅠmRNA、VEGF 及IGF-ⅠmRNA 在肺組織相對表達水平。

1.2.5 肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達水平 將RT-PCR 提取后剩余物按1 500 r/min 離心30 min，取上清為粗體蛋白，根據(jù)二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（北京益德益華生物有限公司）提取并測定肺組織蛋白濃度，將細胞裂解并將其稀釋至相同的蛋白濃度，100℃煮沸5 min 使蛋白變性。每組取蛋白40 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳（SDS-PAGE，70 V，30 min；100 V，90 min）；轉(zhuǎn)膜（200 mA，3 h）至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（或4℃過夜）；一抗1 ∶500，室溫孵育2 h（或4℃過夜）；TPBS 洗滌3 次，PBS 洗滌1 次；之后進行Western 印跡檢測，拍照記錄之后進行軟件的圖像分析，測定各組肺纖維化損傷組織中TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)相對表達水平。

1.2.6 肺組織病理學(xué)變化 干預(yù)6 w 后從4 組中隨機選取5 只大鼠，分別采集大鼠的肺臟組織并進行HE 染色進行大鼠肺組織的病理學(xué)檢測。首先采用甲醛溶液對肺臟組織進行組織固定，采用不同濃度的酒精分別進行自低濃度到高濃度的酒精脫水處理。脫水操作完成后將肺臟組織塊放置于二甲苯中進行透明處理，將組織中的酒精全部替換而出；浸蠟包埋，將蠟塊在切片機上切成5～8 μm 厚的肺組織薄片。小心將所有肺組織薄片進行熨平后貼在載玻片上低溫烘干脫蠟。脫蠟后進行HE 染色，之后分別經(jīng)過酒精脫水和二甲苯透明處理后，在切片上滴加加拿大樹膠封上蓋玻片。樹膠干燥后，在熒光顯微鏡下檢測4 組大鼠肝臟組織病理學(xué)的形態(tài)和變化。

1.2.7 尿液干細胞在肺組織中的存活和分布 干預(yù)6 w 后從4 組中隨機選取5 只大鼠，分別采集大鼠的肺臟組織，并將之制備成冷凍切片并進行4＇，6-二脒基-2 苯基吲哚染色。熒光顯微鏡下進行觀察，在鏡下視野中隨機選取3 個視野拍照記錄；假設(shè)每張照片的總亮度為1，從各張照片之中選取1 個亮點，使用ACDsee5.0 軟件確定其坐標(biāo)。從各個樣本的圖像之中選取8 個視野，分別計數(shù)視野中CFSE標(biāo)記的陽性細胞數(shù)和尿液干細胞總數(shù)，計算得出各組中大鼠肺臟組織中的尿液干細胞標(biāo)記率。

1.2.8 肺泡壁細胞凋亡率 干預(yù)6 w 后從4 組中隨機選取5 只大鼠，取大鼠的肺葉制作石蠟切片，滴加復(fù)合消化酶在切片上進行20 min 的室溫消化；洗滌切片，向其中滴加50 μl 的Tunel 標(biāo)記反應(yīng)混合液37℃下進行孵育1 h；之后滴加50 μl 的POD2 轉(zhuǎn)化液，在37℃下繼續(xù)孵育30 min；用PBS 沖洗4 次后用DBA 顯色，在熒光顯微鏡下觀察各組肺泡壁上的凋亡細胞數(shù)目并計算肺泡壁上細胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進行t檢驗、多組間單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 尿液干細胞形態(tài)及CFSE 標(biāo)記 將尿液干細胞體外條件下復(fù)蘇完成6 h 后，可以在顯微鏡下見到少量的干細胞已經(jīng)開始附著于培養(yǎng)皿的壁和底部。將尿液干細胞接種在細胞培養(yǎng)皿上24 h 后的干細胞形態(tài)。細胞貼在細胞培養(yǎng)皿上逐漸開始生長，顯微鏡下可見尿液干細胞逐漸呈現(xiàn)出長梭形或三角形。見圖1。經(jīng)過CFSE 標(biāo)記的尿液干細胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，尿液干細胞24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 存活率（0.23±0.03、0.30±0.04、0.39±0.05、0.46±0.03、0.58±0.06、0.71±0.05，均P＜0.05）依次上升。

圖1 尿液干細胞形態(tài)及CFSE 標(biāo)記觀察(×40)

2.2 各組肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達水平比較 病理對照組肺泡灌洗TGF-β1、VEGF及IGF-Ⅰ的濃度最高（P＜0.05），與之相比，其余各組以上指示水平均顯著下降（均P＜0.05）且聯(lián)合治療組以上指標(biāo)水平濃度最低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達水平比較(,n=5,μg/L)

表1 各組肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達水平比較(,n=5,μg/L)

與病理對照組比較:1）P＜0.05，與 聯(lián)合治療組比較:2）P＜0.05；下表同

2.3 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達水平比較 病理對照組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-1 濃度最高（P＜0.05），與之相比，其余各組以上指標(biāo)水平均顯著下降，且聯(lián)合治療組以上指標(biāo)水平濃度最低（均P＜0.05）。見表2，圖2。

表2 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達水平比較(,n=5)

表2 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達水平比較(,n=5)

圖2 肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達水平

2.4 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達水平比較 病理對照組中大鼠肺臟組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白相對表達水平最高（P＜0.05）；與之相比，其余各組以上指標(biāo)水平均顯著下降，且聯(lián)合治療組以上指標(biāo)水平濃度最低（均P＜0.05）。見圖3，表3。

圖3 Western 印跡檢測肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白的表達

表3 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達水平比較(,n=5)

表3 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達水平比較(,n=5)

2.5 肺組織病理學(xué)變化 各組肺臟中均出現(xiàn)了不同程度的肺氣腫。病理對照組肺組織中有較為明顯的充血，肺泡中有明顯的纖維性浸潤且可見肺泡的內(nèi)襯間隔較厚。尿液干細胞組和右美托咪定組肺氣腫顯著緩解，可見肺泡內(nèi)襯間隔顯著變薄，充血及纖維性浸潤明細減輕；與尿液干細胞組和右美托咪定組相比，聯(lián)合治療組肺氣腫肺臟組織病理學(xué)變化明顯改善。見圖4。

圖4 各組肺組織病理學(xué)變化(HE,×40)

2.6 尿液干細胞在肺組織中的存活和分布 病理對照組和右美托咪定組中未見有CFSE 標(biāo)記的尿液干細胞；而在尿液干細胞組和聯(lián)合治療組中可以見到有較多的CFSE 標(biāo)記的尿液干細胞存在。且聯(lián)合治療組中的尿液干細胞數(shù)目〔（47.42 ±5.63）個/Hp〕顯著多于尿液干細胞組〔（31.58±4.24）個/Hp，P＜0.05〕。見圖5。

圖5 各組熒光顯微鏡觀察CFSE 標(biāo)記尿液干細胞分布(CFSE,×200)

2.7 肺泡壁細胞凋亡率 病理對照組肺組織中肺泡壁上的細胞凋亡率最高〔（47.10±2.27）%〕，與之相比，右美托咪定組〔（25.53±1.12）%〕和尿液干細胞組〔（26.55±1.14）%〕細胞凋亡率顯著下降（均P＜0.05）；聯(lián)合治療組肺泡壁細胞凋亡率進一步下降〔（14.92±0.85）%，P＜0.05〕。見圖6。

圖6 各組肺泡壁細胞凋亡(Tunel,×100)

3 討論

長期吸煙和慢性炎癥反應(yīng)均會導(dǎo)致肺氣腫〔15，16〕。本研究通過煙熏和氣管內(nèi)滴入豬胰彈生蛋白酶的方法成功構(gòu)建了大鼠肺氣腫病理模型。研究顯示骨髓間充質(zhì)干細胞等多向分化細胞移植在緩解肺氣腫癥狀表現(xiàn)優(yōu)異〔17，18〕。尿液干細胞具有修復(fù)腎臟、骨骼和神經(jīng)損傷的作用〔19，20〕。右美托咪定是臨床上常用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛劑，研究發(fā)現(xiàn)其對多種干細胞均有促進增殖和誘導(dǎo)分化的作用〔21，22〕。

本研究結(jié)果表明單獨治療作用顯著改善了肺氣腫大鼠的肺臟組織形態(tài)學(xué)，緩解因損傷造成的細胞凋亡。右美托咪定是臨床上常用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛劑，能夠通過抑制肺損傷引起的NF-κB、STAT-3 通路的激活進而抑制炎癥反應(yīng)最終起到肺保護作用，故其對肺氣腫有保護作用，改善肺部微環(huán)境，為尿液干細胞移植后發(fā)揮作用提供有利條件，同時研究發(fā)現(xiàn)其對多種干細胞均有促進增殖和誘導(dǎo)分化的作用，右美托咪定同時可能緩解并減輕肺部損傷，其通過影響肺部血管收縮和抑制炎癥等改善肺部損傷〔23，24〕。尿液干細胞則可能具有向損傷部位歸巢并向正常肺臟細胞轉(zhuǎn)化的特性，進而提高肺部損傷的修復(fù)效果。本研究結(jié)果表明，右美托咪定可能具有提高尿液干細胞增殖和活化的作用。這與右美托咪定在體外誘導(dǎo)干細胞增殖活化的作用較為相似，有待進一步研究探討。

TGF-β1 具有調(diào)節(jié)細胞分化生長的功能，而該分子還具有極強的膠原合成促進作用，并可以抑制成纖維細胞的凋亡〔25〕。因此該分子在肺部纖維化和損傷進程中發(fā)揮著重要作用。而IGF-1 和TGF-β1在誘導(dǎo)肺部損傷和纖維化進程中具有協(xié)同作用〔26～30〕。研究表明，VEGF 在肺部纖維化和肺氣腫進程發(fā)揮著促進作用〔31〕。本研究顯示尿液干細胞移植和右美托咪定輸注聯(lián)合顯著降低肺組織和肺泡灌注液中TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ的表達水平，這可能是該聯(lián)合作用改善肺氣腫的機制之一。

TGF-β1 有多種生物學(xué)效應(yīng)，不僅對巨噬細胞、中性粒細胞和成纖維細胞等有很強的趨化作用，同時還能刺激腫瘤壞死因子（TNF）-α，白細胞介素（IL）-6，IL-1β 等炎性細胞因子釋放導(dǎo)致肺損傷進展，故降低TGF-β1 能夠減輕肺損傷〔32〕。研究表明VEGF 持續(xù)高表達與大鼠血管內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)，而血管內(nèi)皮細胞的損傷可能是誘發(fā)大鼠肺纖維化的重要啟動因素之一〔33〕，本研究表明大鼠血管內(nèi)皮細胞損傷減輕，抑制血管新生，發(fā)揮抗肺纖維化作用。IGF-Ⅰ在肺氣腫肺纖維化過程中起促進作用。