張輝芳 李富強 白銀雪 韓燕 尹曉剛

（南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 南陽 473000）

帕金森?。≒D）是一種常見于中老年的以靜息性震顫、運動遲緩、癡呆、步態(tài)障礙和姿勢不穩(wěn)定為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其發(fā)病率在神經(jīng)退行性疾病中位居第二，并有逐步上升趨勢〔1〕。

PD 嚴重影響患者身心健康，并給社會造成沉重的經(jīng)濟負擔。目前，雖已有多種藥物進行PD 治療的臨床試驗，但大多數(shù)藥物的療效并不理想〔2〕。長鏈非編碼RNA（LncRNAs）是一類長度大于200個核苷酸的RNA 轉(zhuǎn)錄本，與機體的細胞周期調(diào)控等多種生物學過程有關(guān)〔3〕。越來越多的證據(jù)表明LncRNAs 參與了包括PD 在內(nèi)的腦相關(guān)神經(jīng)退行性疾病 的進展〔4，5〕。小核仁RNA 宿主基 因（SNHG）1 是新近發(fā)現(xiàn)的LncRNA，位于11q12.3染色體區(qū)域，其在多種癌癥中的作用已被發(fā)現(xiàn)，主要發(fā)揮miRNA 分子海綿作用調(diào)控腫瘤發(fā)生〔6，7〕。Kraus 等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，PD 患者的大腦標本SNHG1表達明顯上調(diào)。1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）可引起活性氧（ROS）形成，線粒體膜電位的改變，其誘導的SH-SY5Y 細胞是研究較透徹的經(jīng)典PD細胞模型。在MPP+預處理的人神經(jīng)母細胞瘤SHSY5Y 細胞中，SNHG1 表達也明顯上調(diào)，過表達SNHG1 促進SH-SY5Y 細胞類包涵體樣蛋白聚集并誘導細胞凋亡，對細胞具有毒性作用〔9〕。但SNHG1 在PD 作用機制尚未完全闡明。因此，本研究采用MPP+預處理SH-SY5Y 細胞構(gòu)建PD 體外細胞模型，旨在探討SNHG1 調(diào)控PD 發(fā)生發(fā)展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 購自中科院上海細胞庫；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素鏈霉素購自美國Gibco 公司；MPP+購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司；si-con、si-LncRNA SNHG1、miR-con、miR-326 mimics、anti-miR-con、anti-miR-326、WT-SNHG1 和 MUTSNHG1 的構(gòu)建和測序及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物均由生工生物工程股份有限公司提供；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；總RNA 提取試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Roche 公司；熒光試驗試劑盒購自大連TaKaRa 生物技術(shù)有限公司；噻唑藍（MTT）試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；RIPA 裂解液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、Western封閉液、洗滌液、乳酸脫氨酶釋放檢測試劑盒購自上海碧云天公司；兔源細胞周期蛋白（Cyclin）D1 抗體、兔源B 細胞淋巴瘤（Bcl）-2 抗體、兔源Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體、兔源酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3 抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購自美國Abcam 公司；鼠源β-actin 抗體購自美國Santa Cruz 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 采用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞，培養(yǎng)液中添加100 U/ml 的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素，培養(yǎng)條件:37℃，5% CO2。當細胞融合度約80%時，采用0.25% 的胰蛋白酶從瓶壁上分離細胞，進行傳代，取傳3 代的對數(shù)期細胞進行實驗。細胞轉(zhuǎn)染:將對數(shù)期SH-SY5Y 細胞2×105個/孔細胞數(shù)接種于6 孔板，當細胞融合度達到50%時，利用LipofectamineTM2000 參照其使用說明將si-con、si-LncRNA SNHG1 分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細胞，培養(yǎng)48 h后，檢測轉(zhuǎn)染效率后進行后續(xù)分析。為進一步驗證LncRNA SNHG1 是通過調(diào)控miR-326 表達進而調(diào)控MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞存活和凋亡，將si-LncRNA SNHG1 與anti-miR-326 或者anti-miR-con 共轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y 細胞，經(jīng)4 mmol/L 的MPP+處理后，檢測SH-SY5Y 細胞的存活和凋亡情況。細胞分組如下:NC 組（正常培養(yǎng)的SH-SY5Y 細胞）、MPP+組（4 mmol/L 的MPP+處理SH-SY5Y 細胞24 h 構(gòu)建PD 的細胞模型）、MPP++si-con 組（轉(zhuǎn)染si-con，用MPP+處理）、MPP++si-LncRNA SNHG1 組（轉(zhuǎn)染si-LncRNA SNHG1，用MPP+處理）、MPP++miR-con 組（轉(zhuǎn)染miR-con，用MPP+處理）、MPP++miR-326 組（轉(zhuǎn)染miR-326 mimics）、MPP++si-LncRNA+antimiR-con 組（共轉(zhuǎn)染si-LncRNA SNHG1 和anti-miRcon，用MPP+處理）和MPP++si-LncRNA+anti-miR-326 組（共轉(zhuǎn)染si-LncRNA SNHG1 和anti-miR-326，用MPP+處理）。MPP+濃度及處理時間參照文獻〔10〕進行。

1.3 qRT-PCR 檢測 利用總RNA 提取試劑盒分別提取各組SH-SY5Y 細胞的總RNA，并檢測其濃度和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA 為模板利用熒光試驗試劑盒進行qPCR 擴增。用2-ΔΔCt法計算SNHG1 和miR-326 的相對表達量，分別以β-actin 和U6 為內(nèi)參。引物序列如下（5＇-3＇）:U6:上游引物TCCGATCGTGAAGCGTTC，下游引物GTGCAGGGTCCGAGGT；miR-326:上游引物CCTCTGGGCCCTTCCTCCAG，下游引物GCTGTCAACGATACGCTACCTA；SNHG1:上游引物CCCCATGATGGTTCCTCAGTT，下游引物GGAAAGCAAGTGCAGGTTAGTC；β-actin:上游引物TATGCTCTCCCTCACGCCA，下游引物TTTACGGATGTCAACGTCACAC。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測 利用生物信息軟件預測SNHG1 的靶基因。發(fā)現(xiàn)SNHG1 與miR-326能夠部分特異性結(jié)合，猜測miR-326 是SNHG1 的靶基因，并進行驗證。構(gòu)建野生型WT-SNHG1 和突變型MUT-SNHG1 的SNHG1-3＇UTR 熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM2000 將miR-326 模擬物和miR-con 分別與WT-SNHG1 和MUT-SNHG1 共轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y 細胞，培養(yǎng)48 h 后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組SH-SY5Y 細胞的熒光素酶活性。

1.5 MTT 比色法檢測細胞活力 將SH-SY5Y 細胞按照2×103個/孔接種于96 孔板，按照1.2 細胞分組進行相應(yīng)處理后，培養(yǎng)48 h 后，加入MTT 試劑（20 μl/孔），孵育4 h 后，棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）（150 μl/孔），繼續(xù)孵育2 h 直至結(jié)晶完全溶解，用酶標儀在490 nm 波長處檢測各孔的OD 值，計算細胞存活率。

1.6 乳酸脫氫酶（LDH）釋放量 將適量SH-SY5Y細胞接種到96 孔板中，使待檢測時細胞密度約為70%。吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗滌1 次。更換為含1%血清DMEM 培養(yǎng)基按照1.2 進行分組和細胞處理，在預定的檢測時間1 h 前，從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板，在未經(jīng)藥物處理用于后續(xù)裂解的細胞孔加入體積為原有培養(yǎng)液10%的LDH 釋放試劑，反復數(shù)次混勻，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，到達時間后，細胞培養(yǎng)板離心后，分別取各孔的上清液120 μl，加入新的96 孔板相應(yīng)孔中，隨即進行樣品測定。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組對數(shù)期SH-SY5Y 細胞，用預冷的PBS 液洗滌細胞，加入適量的1×結(jié)合緩沖液懸浮細胞，離心后棄上清。再次加入1×結(jié)合緩沖液懸浮細胞，使細胞濃度約為1×106個/ml，取100 μl 細胞懸液加入流式管內(nèi)，加入5 μl的Annexin V-FITC，室溫避光混勻10 min，加入5 μl的PI，室溫避光孵育5 min 后，補加PBS 液至500 μl，輕輕混勻，30 min 內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 Western 印跡檢測 采用RIPA 裂解液裂解各組SH-SY5Y 細胞，提取細胞蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進行蛋白定量。隨后按照細胞蛋白變性-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-洗膜-Ⅰ抗孵育-洗膜-Ⅱ抗孵育-ECL 顯影-拍照-目的條帶定量分析步驟進行（以β-actin 為內(nèi)參）。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MPP+處理SH-SY5Y 細胞對LncRNA SNHG1和miR-326 表達的影響 與NC 組比較，MPP+組SH-SY5 Y細胞LncRNASNHG1 的表達水平顯著升高，miR-326 的表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 MPP+處理SH-SY5Y 細胞對LncRNA SNHG1 和miR-326 表達的影響(,n=9)

表1 MPP+處理SH-SY5Y 細胞對LncRNA SNHG1 和miR-326 表達的影響(,n=9)

2.2 沉默LncRNA SNHG1 對MPP+處理SH-SY5Y細胞存活的影響 與NC 組相比，MPP+組SH-SY5Y細胞LncRNA SNHG1 的表達水平顯著升高，LDH 的釋放量顯著增加，CyclinD1 蛋白表達水平顯著降低，細胞存活率顯著降低（均P＜0.05）；與MPP++si-con組比較，MPP++si-LncRNA SNHG1 組SH-SY5Y 細胞LncRNA SNHG1 的表達水平顯著降低，LDH 的釋放量顯著減少，CyclinD1 蛋白的表達水平顯著升高，細胞存活率顯著升高（均P＜0.05）。見圖1，表2。

圖1 Western 印跡檢測CyclinD1 蛋白表達

表2 沉默LncRNA SNHG1 對MPP+處理SH-SY5Y 細胞存活及凋亡的影響(,n=9)

表2 沉默LncRNA SNHG1 對MPP+處理SH-SY5Y 細胞存活及凋亡的影響(,n=9)

與NC 組比較:1）P＜0.05；與MPP++si-con 組比較:2）P＜0.05

2.3 沉默LncRNA SNHG1 對MPP+處理SH-SY5Y細胞凋亡的影響 與NC 組相比，MPP+組SH-SY5Y細胞SH-SY5Y 細胞Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax和酶切caspase-3 表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著升高（均P＜0.05）；與MPP++si-con 組比較，MPP++si-LncRNA SNHG1 組SH-SY5Y 細胞Bcl-2 表達水平顯著升高，Bax 和酶切caspase-3 表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖2、圖3。

圖2 流式細胞術(shù)檢測SH-SY5Y 細胞凋亡

圖3 Western 印跡檢測Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白和酶切caspase-3 蛋白表達

2.4 LncRNA SNHG1 靶向調(diào)控miR-326 表達 生物信息學軟件進行靶基因預測顯示，見圖4，LncRNA SNHG1 與miR-326 存在部分連續(xù)特異性結(jié)合位點。與miR-con 和WT-LncRNA SNHG1 共轉(zhuǎn)染組相比，miR-326 和WT-LncRNA SNHG1 共轉(zhuǎn)染組SHSY5Y 細胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與miR-con 和MUT-LncRNA SNHG1 共轉(zhuǎn)染組相比，miR-326 和MUT-LncRNA SNHG1 共轉(zhuǎn)染組SHSY5Y 細胞的熒光素酶活性無明顯變化（P＜0.05）。見表3。與si-con 組SH-SY5Y 細胞miR-326 的表達水平（1.00±0.12）相比，si-LncRNA SNHG1 組表達水平（4.16±0.63）顯著升高（P＜0.05）；與pcDNA組SH-SY5Y 細胞miR-326 的表達水平（0.95±0.15）比較，pcDNA-LncRNA SNHG1 組表達水平（0.65±0.06）顯著降低（P＜0.05）。提示，miR-326 是LncRNA SNHG1 的靶基因，LncRNA SNHG1 可靶向負性調(diào)控miR-326 的表達。

圖4 LncRNA SNHG1 與miR-326 存在靶向位點

表3 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

表3 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

2.5 過表達miR-326 對MPP+處理SH-SY5Y 細胞存活和凋亡的影響 與NC 組相比，MPP+組SHSY5Y 細胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax 表達水平顯著升高（均P＜0.05），LDH釋放量顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；與MPP++miR-con 組相比，MPP++miR-326 組SH-SY5Y 細胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表達水平顯著升高，Bax 表達水平顯著降低，LDH 釋放量顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（均P＜0.05）。見圖5，表4。

表4 轉(zhuǎn)染miR-326 增加MPP+處理SH-SY5Y 細胞存活抑制細胞凋亡(,n=9)

表4 轉(zhuǎn)染miR-326 增加MPP+處理SH-SY5Y 細胞存活抑制細胞凋亡(,n=9)

與NC 組比較:1）P＜0.05；與MPP++miR-con 組比較:2）P＜0.05

圖5 Western 印跡檢測CyclinD1 蛋白、Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白和酶切caspase-3 蛋白表達

2.6 抑制miR-326 逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA SNHG1 對MPP+處理SH-SY5Y 細胞存活和凋亡的影響 與MPP++si-con 組相比，MPP++si-LncRNA SNHG1 組SH-SY5Y 細胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表達水平顯著升高，Bax 表達水平顯著降低，LDH 釋放量顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與MPP++si-LncRNA+anti-miR-con 組相比，MPP++si-LncRNA+anti-miR-326 組SH-SY5Y 細胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax 表達水平顯著升高，LDH 釋放量顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見表5，圖6。

圖6 Western 印跡檢測CyclinD1、Bcl-2、Bax 和酶切caspase-3 表達

表5 干擾miR-326 逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA SNHG1 對MPP+處理SH-SY5Y 細胞促進存活和抑制凋亡的作用(,n=9)

表5 干擾miR-326 逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA SNHG1 對MPP+處理SH-SY5Y 細胞促進存活和抑制凋亡的作用(,n=9)

與MPP++si-con 組比較:1）P＜0.05；與MPP++si-LncRNA SNHG1+anti-miR-con 組比較:2）P＜0.05

3 討論

PD 是由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少而引起的一種神經(jīng)退行性疾病，多巴胺生成的逐漸喪失是PD的重要病理特征〔11〕。遺傳、環(huán)境、生活方式等因素與PD 的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，全球65 歲以上人群中PD 病率為1%～2%〔12〕。SNHG1 屬于宿主核仁小分子RNA 家族成員之一，其在多種惡性腫瘤中的作用已被廣泛報道。SNHG1 在PD 中的作用被逐漸揭示。研究發(fā)現(xiàn)，SNHG1 通過發(fā)揮miR-7 競爭性內(nèi)源RNA 作用，上調(diào)NLRP3 表達，促進炎性小體活化，促進PD 神經(jīng)炎癥的發(fā)生〔13〕；Xie 等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，SNHG1 的上調(diào)增強了MPP+對誘導的SH-SY5Y細胞毒性，細胞活力降低，ROS 生成增加，同時伴有caspase-3 上調(diào)和細胞色素C 的釋放；此外，SNHG1的上調(diào)還可促進MPP+對誘導的SH-SY5Y 細胞LDH的釋放，而干擾SNHG1 則具有神經(jīng)保護作用。LDH的釋放量顯著增加，Bax 和酶切caspase-3 蛋白表達增加，Bcl-2 和CyclinD1 蛋白的表達顯著降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默SNHG1 能夠降低MPP+處理對SH-SY5Y 的細胞毒性，抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。提示SNHG1 參與PD 的進展。

已有研究報道SNHG1 通過發(fā)揮miRNA 分子海綿作用參與調(diào)控人類疾病的發(fā)生發(fā)展〔15〕。miR-326首次發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)元中，在Notch 通路抑制劑處理的斑馬魚胚胎中表達上調(diào)。既往研究表明，在PD 小鼠模型中，miR-326 的表達下調(diào)，過表達miR-326 通過抑制激肽釋放酶（klk）7 介導的絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號通路，抑制PD 細胞凋亡，促進多巴胺能神經(jīng)元增殖〔16〕；miR-326 靶向XBP1 通過JNK 信號抑制一氧化氮合酶表達，還可促進多巴胺能神經(jīng)元的自噬〔17〕。此外，在阿爾茨海默病小鼠模型中，miR-326 負調(diào)控VAV1 的表達，抑制JNK 信號通路的激活，抑制阿爾茨海默病模型小鼠神經(jīng)元凋亡〔18〕。本研究結(jié)果提示SNHG1 通過靶向miR-326抑制MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡，促進細胞存活。但LncRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復雜，SNHG1 可能通過調(diào)控miR-326/mRNA 分子軸發(fā)揮作用，miR-326 下游靶基因有待進一步研究。

綜上，SNHG1 在MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞中表達上調(diào)，miR-326 表達下調(diào)，SNHG1 通過吸附miR-326 能夠抑制MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡，減輕其對細胞的毒性作用。