余婷 高原小雪 謝宇端 胡玉海 田佩孚

（1 武漢市精神衛(wèi)生中心檢驗(yàn)科,湖北 武漢 430012;2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院檢驗(yàn)科;3 武漢市漢口醫(yī)院檢驗(yàn)科）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病最普遍的并發(fā)癥之一，大約影響40%的1 型和2 型糖尿病患者，晚期通常導(dǎo)致慢性腎衰竭〔1〕。高血糖引發(fā)導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞（GMC）凋亡和缺失是DN 病理進(jìn)展的關(guān)鍵因素〔2〕。和厚樸酚（honokiol）是一種小分子多酚類物質(zhì)，源自木蘭屬植物，在臨床前模型中已被證實(shí)具有抗炎、抗血管生成和抗腫瘤活性〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚可以作為人結(jié)直腸癌的潛在新型化療藥物〔4〕，對(duì)體外大鼠腎小球系膜增生具有潛在的治療作用〔5〕。研究表明，miR-155 廣泛參與機(jī)體造血細(xì)胞的發(fā)育和分化，免疫細(xì)胞的發(fā)育分化、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等生物過程，并且在肝癌、乳腺癌、胰腺癌等多種癌組織或細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔6〕。miR-155 在DN 腎組織和高糖刺激的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)〔7〕。Smad3 屬于Smad 蛋白家族，參與胚胎發(fā)育、骨骼和器官形成，其水平在癌癥和肝腎損傷的組織中異常表達(dá)〔8，11〕。但是和厚樸酚、miR-155 和Smad3 在高糖損傷的小鼠腎小球系膜細(xì)胞（MGMC）中的作用與聯(lián)系尚未可知。本研究建立高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡模型，檢測(cè)和厚樸酚抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡的作用機(jī)制，并探尋Smad3 和miR-155 在和厚樸酚對(duì)減輕糖尿病腎損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 MGMC（SV40-MES-13；購(gòu)自美國(guó)ATCC）；和厚樸酚（≥98%；購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；抗Smad3 抗體和抗β-actin 抗體（購(gòu)自美國(guó)Abcam公司）；Lipofectamine 2000 總RNA 提取試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR 試劑盒、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Thermo）；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SV40-MES-13 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1% 青-鏈霉素）中和37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中。

實(shí)驗(yàn)分組:空白組、高糖組、高糖+和厚樸酚組。其中，空白組含5 mmol/L D-葡萄糖；高糖組含30 mmol/L D-葡萄糖；高 糖+和厚樸 酚組含30 mmol/L D-葡萄糖+40 μg/ml 和厚樸酚。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在6 孔板中接種SV40-MES-13細(xì)胞（2×105個(gè)/孔）。待SV40-MES-13 細(xì)胞基本融合為一層時(shí)，遵循Lipofectamine 2000 試劑操作指南，用無血清DMEM 稀釋miR-con、miR-155、si-con、si-Smad3、anti-miR-con、anti-miR-155、野生型（WT）-Smad3+miR-con、WT-Smad3+miR-155、突變型（MUT）-Smad3+miR-con 和MUT-Smad3+miR-155、anti-miR-155+si-con、anti-miR-155+si-Smad3 等載體，取等體積Lipofectamine 2000 與各組載體充分混合20 min，將其加至SV40-MES-13 細(xì)胞中，6 h 后更換為完全DMEM，繼續(xù)轉(zhuǎn)染48 h，收獲SV40-MES-13 細(xì)胞。

1.2.3 Real-time PCR 檢測(cè)miR-155 和Smad3 mRNA 的表達(dá) 收集各組SV40-MES-13 細(xì)胞，提取總RNA，按照16℃30 min、42℃30 min、82℃5 min 的反應(yīng)程序合成cDNA，獲得的cDNA 于4℃放置10 min，保存在-80℃。取cDNA 按照real-time PCR試劑盒的操作規(guī)程說明，按照95℃ 5 min；95℃15 s、60℃30 s、72℃40 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃10 min的反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。引物序列:miR-155 上游引物5＇-TTAATGCTAATCGTGATAGG-3＇，下游引物為試劑盒內(nèi)通用引物；Smad3 上游5＇-GAGAGGTGTGCGGCTCTACT-3＇，下游5＇-CTGGTTGCAGTTGGGAGACT-3＇；內(nèi)參照β-actin 上游5＇-CATTGCTGACAGGATGCAGA-3＇，下 游5＇-CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3＇。miR-155 和Smad3 mRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)通過在Bio-Rad PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 SV40-MES-13 細(xì)胞經(jīng) 高糖和（或）和厚樸酚（20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理后，接種至6 孔板（2×104個(gè)/孔），培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，按照Annexin V/PI試劑盒操作指南，室溫黑暗條件下將細(xì)胞與5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI 混勻，20 min，后于在流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定凋亡率（%）檢測(cè)。

1.2.5 Western 印跡檢測(cè)Smad3 蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)48 h 的各組SV40-MES-13 細(xì)胞（空白組、高糖組、試驗(yàn)組）以RIPA 裂解液提取蛋白，經(jīng)BCA 法試劑測(cè)量其濃度。蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，后4℃加入抗Smad3 和抗β-actin（內(nèi)參照）一抗，4℃孵育保持12 h，室溫下加入稀釋的二抗，孵育2 h 后，分析Smad3 蛋白水平。

1.2.6 雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 將SV40-MES-13 細(xì)胞接種于24 孔板（1×104個(gè)/孔），培養(yǎng)至80%～90%融合。構(gòu)建miR-155 結(jié)合位點(diǎn)的Smad3雙熒光素酶報(bào)告載體WT-Smad3 和MUT-Smad3，然后分別在SV40-MES-13 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-con 或miR-155。48 h 后，在室溫下將SV40-MES-13 細(xì)胞與裂解液反應(yīng)20 min，加入熒光素酶底物測(cè)量熒光素酶活性。分析螢火蟲相對(duì)于海腎的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的和厚樸酚對(duì)高糖誘導(dǎo)MGMC 凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白組〔（8.59±0.96）%〕相比，高糖組的細(xì)胞凋亡率〔（32.64±2.76）%〕顯著上升（P＜0.05）；與高糖組相比，高糖+和厚樸 酚20 μmol/L 組、高 糖+和厚樸 酚40 μmol/L組、高糖+和厚樸酚80 μmol/L 組的細(xì)胞凋亡率均顯著下降〔（24.55±3.05）%、（15.38±2.37）%、（18.26±2.18）%；P＜0.05〕；與高糖+和厚樸酚20 μmol/L組相比，高糖+和厚樸酚40 μmol/L組細(xì)胞凋亡率減少且差異顯著（P＜0.05）。說明和厚樸酚可以抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，40 μmol/L 和厚樸酚抑制細(xì)胞凋亡效果最佳，選擇和厚樸酚40 μmol/L 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 和厚樸酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的MGMC 中miR-155 和Smad3 表達(dá)的影響 qRT-PCR 和Western 印跡結(jié)果顯示（圖1 和表1），與空白組相比，高糖組的MGMC中miR-155 表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），Smad3 mRNA 和Smad3 蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與高糖組相比，高糖組+和厚樸酚組的MGMC 細(xì)胞中miR-155 表達(dá)量比高糖組增加（P＜0.05），Smad3 mRNA 和Smad3 蛋白表達(dá)量顯著減少（P＜0.05）。

圖1 檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞Smad3 蛋白的表達(dá)

表1 和厚樸酚對(duì)高糖誘導(dǎo)MGMC 中miR-155 和Smad3 表達(dá)的影響(,n=3)

表1 和厚樸酚對(duì)高糖誘導(dǎo)MGMC 中miR-155 和Smad3 表達(dá)的影響(,n=3)

與空白組相比較:1）P＜0.05；與高糖組相比較:2）P＜0.05

2.3 過表達(dá)miR-155 抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 細(xì)胞凋亡 qRT-PCR 和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明（表2），與高糖+miR-con 組相比，高糖+miR-155 組的MGMC中miR-155 表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），而MGMC細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.05）。

表2 過表達(dá)miR-155 對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響(,n=3)

表2 過表達(dá)miR-155 對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響(,n=3)

2.4 miR-155 靶向調(diào)控Smad3 的表達(dá) Targetscan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖2A），miR-155 靶向Smad3 的3＇UTR。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示（表3），miR-155 組WT-Smad3 的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性比miR-con 組顯著下降（P＜0.05），而miR-155 組、miRcon 組MUT-Smad3 的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性無明顯變化（P＞0.05）。Western 印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2B），miR-155 組的Smad3 蛋白表達(dá)量（0.18±0.05）比miRcon 組（0.59±0.06）顯著下降（P＜0.05）；anti-miR-155組的Smad3 蛋白表達(dá)量（1.35±0.11）比anti-miR-con組（0.54±0.05）顯著上升（P＜0.05）。

圖2 miR-155 靶向Smad3 mRNA 的3′UTR 調(diào)控其表達(dá)

表3 miR-155 與Smad3 的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=3)

表3 miR-155 與Smad3 的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=3)

2.5 沉默Smad3 抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡 高糖組+si-Smad3 組的MGMC 中Smad3 mRNA 和蛋白表達(dá)量比高糖+si-con 組顯著下降（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率也比高糖+si-con 組顯著下降（P＜0.05）。見圖3、表4。

圖3 檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞Smad3 蛋白表達(dá)

表4 沉默Smad3 抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡(,n=3)

表4 沉默Smad3 抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡(,n=3)

2.6 和厚樸酚通過miR-155 靶向Smad3 表達(dá)影響調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡 與高糖+和厚樸酚+anti-miR-con 組相比，高糖+和厚樸酚+anti-miR-155組的Smad3 mRNA、蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均顯著上升（P＜0.05）；與高糖+和厚樸酚+anti-miR-155+si-con 組相比，高糖+和厚樸酚+anti-miR-155+si-Smad3 組Smad3 mRNA、蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均顯著下降（P＜0.05）。見圖4，表5。

圖4 檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞Smad3 蛋白表達(dá)

表5 和厚樸酚通過miR-155 靶向Smad3 調(diào)節(jié)抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡(,n=3)

表5 和厚樸酚通過miR-155 靶向Smad3 調(diào)節(jié)抑制高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡(,n=3)

與高糖+和厚樸酚+anti-miR-con 組相比較:1）P＜0.05；與高糖+和厚樸酚+anti-miR-155+si-con 組相比較:2）P＜0.05

3 討論

2013 年，我國(guó)糖尿病患病率已超過10%，而糖尿病引發(fā)的并發(fā)癥已成為威脅患者健康和生命的重大問題〔12，13〕。糖尿病并發(fā)癥通常引發(fā)DN，通常伴有系膜細(xì)胞功能障礙高血糖可造成GMC 脫落和凋亡〔14，15〕。因此，探索高糖誘導(dǎo)GMC 凋亡過程的潛在分子機(jī)制，是DN 的研究熱點(diǎn)。

和厚樸酚是玉蘭科中藥中的一種多酚類活性成分，具有抗炎、抗血管增生的作用，能夠減輕促纖維化和促炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)，成為預(yù)防腎纖維化的治療藥物〔16〕。研究表明，在內(nèi)毒素刺激的人GMC 模型中，和厚樸酚通過抑制炎性因子水平，有效保護(hù)腎損傷〔17〕。在腎臟缺血再灌注損傷中，和厚樸酚通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和抑制凋亡進(jìn)而改善腎臟損傷〔18〕。本研究中，高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡可被不同濃度的和厚樸酚所抑制，證實(shí)和厚樸酚對(duì)DN 具有潛在的臨床抑制作用。

miR-155 是miRNA 家族中典型的多功能miRNA，miR-155 參與造血、免疫、炎癥和腫瘤形成和發(fā)展等生物過程，與細(xì)胞增殖、凋亡等密切相關(guān)〔19〕。Gao 等〔20〕在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中檢測(cè)到高水平的miR-155，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的增殖和侵襲。Beltrami 等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 在DN 患者尿液標(biāo)本、腎小球中表達(dá)豐富。本研究表明，和厚樸酚促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的MGMC 中miR-155 的表達(dá)；過表達(dá)miR-155 抑制高糖促M(fèi)GMC 凋亡的效果，下調(diào)miR-155 可逆轉(zhuǎn)和厚樸酚對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的抑制作用，說明在高糖誘導(dǎo)的MGMC 中，和厚樸酚通過上調(diào)miR-155 的表達(dá)，減輕MGMC 凋亡。

已知Smad3 是多種生物過程的重要參與者，如細(xì)胞凋亡、增殖、干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等，它介導(dǎo)TGF-β 的促纖維化活性〔22〕。資料顯示，Smad3 磷酸化水平在暴露于高糖的足細(xì)胞中增強(qiáng)，低表達(dá)Smad3 可拮抗高糖刺激的足細(xì)胞凋亡〔23〕。本研究結(jié)果與上述結(jié)果類似，即高糖使MGMC 中的Smad3表達(dá)上調(diào)，沉默Smad3 能減輕高糖誘導(dǎo)的MGMC 凋亡。另外，高糖導(dǎo)致的Smad3 高表達(dá)被和厚樸酚所抑制，說明和厚樸酚抑制MGMC 凋亡與抑制Smad3有關(guān)。本研究中，Targetscan 軟件、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合Western 印跡實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)證實(shí)出miR-155 與Smad3 的3＇UTR 部分互補(bǔ)配對(duì)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)miR-155 對(duì)Smad3 的調(diào)控功能，并說明在高糖誘導(dǎo)的MGMC 中，和厚樸酚對(duì)高糖損傷MGMC 凋亡的抑制作用是通過miR-155 靶向Smad3從而抑制細(xì)胞凋亡；體現(xiàn)了miR-155 對(duì)Smad3 的調(diào)控功能。

本研究首次闡述了和厚樸酚高糖誘導(dǎo)的MGMC細(xì)胞中通過上調(diào)miR-155 靶向Smad3，抑制減輕高糖誘導(dǎo)的MGMC 細(xì)胞凋亡，揭示了和厚樸酚在治療DN 中的重要臨床意義。