羅劍鋒 羅丹 文丹寧 （武漢市金銀潭醫(yī)院感染科,湖北 武漢 430000）

肺炎鏈球菌是引起老年人社區(qū)獲得性肺炎（CAP）的第二常見病原體。病原學(xué)調(diào)查顯示，由革蘭陽性球菌引起的老年人CAP 患者中肺炎鏈球菌感染率高達(dá)58.8%〔1〕。近年來由于抗生素的廣泛應(yīng)用，肺炎鏈球菌耐藥率不斷上升，耐藥現(xiàn)狀不容樂觀〔2〕。因此，尋找有肺炎鏈球菌治療作用的非抗生素藥至關(guān)重要。藁本內(nèi)酯（LIG）是我國傳統(tǒng)中藥傘形科植物當(dāng)歸揮發(fā)油的主要活性成分，研究表明，LIG 有較強的解痙、平喘和鎮(zhèn)靜作用。此外，LIG 在血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞系中有抗炎及抗凋亡作用〔3～5〕。然而，LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護作用尚不清楚。死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）1 是一種廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸激酶，最近研究發(fā)現(xiàn)，DAPK1 在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制其表達(dá)可明顯降低LPS 誘導(dǎo)的血清炎癥因子水平〔6〕。三七皂苷Rb1 通過下調(diào)DAPK1 表達(dá)阻止神經(jīng)細(xì)胞死亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔7〕。但LIG 能否通過調(diào)控DAPK1表達(dá)進而影響肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷目前還尚未可知。本研究通過觀察LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡、炎性因子分泌及DAPK1 表達(dá)的影響，初步探索LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 LIG，純度＞89%，批號為111737-201608，配制為用適量的二甲基亞砜溶解后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）進行稀釋，購自中國食品藥品檢定研究院；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549 購自上海斯信生物科技有限公司；ATCC BAA-255 肺炎鏈球菌購自美國ATCC；RPMI1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone 公司；青霉素鏈霉素混合液、白細(xì)胞介素（IL）-6 檢測試劑盒、IL-10 檢測試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、托休二氏肉湯（THB）購自青島海博生物；DAPK1 小干擾RNA（si-DAPK1）、小干擾RNA 陰性對照（si-NC）、空載體質(zhì)粒（pcDNA）及DAPK1 過表達(dá)載體（pcDNA-DAPK1）的構(gòu)建和測序由上海吉瑪公司提供；LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司；膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔源DAPK1 抗體購自美國CST 公司；兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）3 抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗購自美國Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549 細(xì)胞使用含10%胎牛血清、100 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。肺炎鏈球菌培養(yǎng)于含有5%脫纖維羊血的TSA 平板中，當(dāng)進行細(xì)胞實驗時挑選單克隆菌株在含有0.5%酵母THB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，將菌液離心后，將沉淀懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3 實驗分組與處理 將A549 細(xì)胞分為對照組、感染組、感染+LIG-低組、感染+LIG-中組、感染+LIG-高組、感染+si-NC 組、感染+si-DAPK1 組、感染+LIG+pcDNA 組、感染+LIG+pcDNA-DAPK1 組。對照組為正常培養(yǎng)的A549 細(xì)胞。感染組為當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，采用1×108CFU/ml 的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞。感染+LIG-低組、感染+LIG-中組、感染+LIG-高組為肺炎鏈球菌感染后分別采用不同濃度（10、20、40 μmol/L）的LIG 處理A549 細(xì)胞24 h。感染+si-NC 組、感染+si-DAPK1 組為在肺炎鏈球菌感染前48 h 將si-NC、si-DAPK1 分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞。感染+LIG+pcDNA 組、感染+LIG+pcDNADAPK1 組為在肺炎鏈球菌感染前48 h 將pcDNA、pcDNA-DAPK1 分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，肺炎鏈球菌感染后，采用40 μmol/L 的LIG 處理A549 細(xì)胞24 h。肺炎鏈球菌感染方法參照文獻(xiàn)〔8〕進行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 使用說明書進行。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測培養(yǎng)液中IL-6 和IL-10 水平 各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA 試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6 和IL-10 水平。步驟參考試劑盒說明書，在反應(yīng)孔內(nèi)加入100 μl 的待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，在空白對照孔內(nèi)加入100 μl 的稀釋液，利用空白對照孔進行調(diào)零后，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計算IL-6 和IL-10 水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h 后，采用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，隨后將其轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 r/min 離心10 min，棄去上清液后，收集細(xì)胞，采用PBS 洗滌各組細(xì)胞3 次。向離心管內(nèi)加入200 μl 的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入10 μl 的Annexin V-FITC 和5 μl的PI 染液，混勻后，室溫避光孵育15 min，補充300 μl的結(jié)合緩沖液后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 qRT-PCR 檢測DAPK1 mRNA 的表達(dá) 各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h 后，采用Trizol 法提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA 濃度和純度。采用cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，采用實時熒光定量PCR 試劑盒進行PCR 擴增。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算DAPK1 mRNA 的表達(dá)水平。DAPK1 上游引物序列為5＇-CGAGGTGATGGTGTATGGTG-3＇，下游引物序列為5＇-CTGTGCTTTGCTGGTGGA-3＇；GAPDH 上游引物序列為5＇-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3＇，下游引物序列為5＇-GCCATCACGCCACAGTTTC-3＇。

1.7 Western 印跡檢測Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3及DAPK1 蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h 后，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，并進行蛋白定量。將細(xì)胞蛋白與等體積上樣緩沖液混合，沸水浴5 min 使其充分變性。取30 μg 的蛋白樣品加入凝膠加樣孔，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉膜1 h，再與稀釋的Bcl-2、Bax、酶切caspase3 及DAPK1 抗體室溫孵育2 h，與HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，按照ECL 發(fā)光試劑盒進行發(fā)光顯色，采用ImageJ 分析各目的條帶的灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，分析各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleavedcaspase3 及DAPK1 蛋白表達(dá)變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 與對照組比較，感染組IL-6 水平顯著升高，IL-10 水平顯著降低（均P＜0.05）；與感染組比較，感染+LIG-低、中、高組IL-6 水平均顯著降低，IL-10 水平均顯著升高，且呈顯著的濃度依賴性（均P＜0.05）。見表1。

表1 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響(,n=9)

表1 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響(,n=9)

與對照組比較:1）P＜0.05；與感染組比較:2）P＜0.05；與感染+LIG-低組比較:3）P＜0.05；與感染組+LIG-中組比較:4）P＜0.05；表2 同

2.2 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，感染組凋亡率顯著增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax 和酶切caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05）；與感染組比較，感染+LIG-低、中、高組細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bcl-2 蛋白水平顯著升高，Bax 和酶切caspase3 蛋白水平顯著降低，且呈顯著的濃度依賴性（均P＜0.05）。見圖1，圖2，表2。

圖1 Western 印跡檢測凋亡蛋白的表達(dá)

圖2 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

2.3 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞中DAPK1 表達(dá)的影響 與對照組比較，感染組DAPK1 mRNA 和DAPK1 蛋白水平顯著升高（均P＜0.05）；與感染組比較，感染+LIG-低、中、高組DAPK1 mRNA 和DAPK1 蛋白水平顯著降低，且呈顯著的劑量依賴性（均P＜0.05）。后續(xù)選取LIG 40 μmol/L 濃度進行實驗。見表2，圖3。

表2 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡DAPK1 的影響(,n=9)

表2 LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡DAPK1 的影響(,n=9)

圖3 Western 印跡檢測DAPK1 蛋白的表達(dá)

2.4 抑制DAPK1 表達(dá)對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響 見表3，圖4。與對照組比較，感染組DAPK1 蛋白、IL-6、Bax 蛋白、酶切caspase3蛋白水平顯著升高，IL-10 和Bcl-2 蛋白水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（均P＜0.05）；與感染+si-NC 組比較，感染+si-DAPK1 組DAPK1 蛋白、IL-6、Bax 蛋白、酶切caspase3 蛋白水平顯著降低，IL-10和Bcl-2 蛋白水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（均P＜0.05）。

圖4 Western 印跡檢測DAPK1 和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 抑制DAPK1 表達(dá)對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

表3 抑制DAPK1 表達(dá)對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

與對照組比較:1）P＜0.05；與感染+si-NC 組比較:2）P＜0.05

2.5 DAPK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LIG（40 μmol/L）對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用 與感染組比較，感染+LIG 組DAPK1 蛋白、IL-6、Bax 蛋白、酶切caspase3 蛋白水平顯著降低，IL-10 和Bcl-2 蛋白水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；與感染+LIG+pcDNA組比較，感染+LIG+pcDNA-DAPK1 組DAPK1 蛋白、IL-6、Bax 蛋白、酶切caspase3 蛋白水平顯著升高，IL-10 和Bcl-2 蛋白水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（均P＜0.05）。見圖5，圖6，表4。

圖5 DAPK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了藁本內(nèi)酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

圖6 DAPK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

表4 DAPK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用(,n=9)

表4 DAPK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LIG 對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用(,n=9)

與感染組比較:1）P＜0.05；與感染+LIG+pcDNA 組比較:2）P＜0.05

3 討論

臨床主要通過抗生素來治療肺炎鏈球菌肺炎，然而肺炎鏈球菌對紅霉素、四環(huán)素等抗生素的耐藥現(xiàn)狀日益嚴(yán)峻，并出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象〔9〕。因此，尋找新的有效肺炎鏈球菌肺炎治療藥物迫在眉睫。

LIG 是中草藥當(dāng)歸和川芎的主要脂溶性成分，有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，已被廣泛用于各種疾病的治療。例如，LIG 可減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷和氧化損傷，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能〔10，11〕。LIG 還可抑制血管緊張素（Ang）Ⅱ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大，其機制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)〔12〕。在成肌細(xì)胞分化過程中，LIG 還可促進細(xì)胞增殖，抑制腫瘤壞死因子（TNF）-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔13〕。此外，LIG 對神經(jīng)元細(xì)胞有抗凋亡作用，是預(yù)防血管性癡呆的有效藥物〔14〕。然而，LIG 對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響尚未可知。IL-6 和IL-10作為重要的炎性介質(zhì)，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在肺炎的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。酶切caspase 3 是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要酶，在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中起重要作用。在細(xì)胞凋亡早期，Bcl-2 與Bax 蛋白形成的異源二聚體是細(xì)胞凋亡的啟動子，控制細(xì)胞凋亡。本研究提示LIG 對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷有保護作用。

DAPK1 是一種重要的凋亡正性調(diào)節(jié)因子，其廣泛參與多種途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究顯示，大鼠彌漫性軸索損傷后，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與大鼠胼胝體、腦干組織中DAPK1 蛋白表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，他克莫司通過抑制DAPK1 表達(dá)對實驗性彌漫性軸索損傷后神經(jīng)元凋亡和軸索損傷具有 保護 作用〔15，16〕。miR-98 通過抑制DAPK1 表達(dá)可顯著降低心肌的氧化應(yīng)激、缺血性損傷及心肌細(xì)胞凋亡〔17〕。此外，DAPK1 表達(dá)異常與PM2.5 引起的支氣管上皮損傷相關(guān)〔18〕。本研究推測DAPK1 參與了肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷過程。抑制DAPK1 能顯著降低IL-6 表達(dá)，促進IL-10 表達(dá)，抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，與LIG 對肺泡上皮細(xì)胞的保護作用一致。進一步研究證實過表達(dá)DAPK1 逆轉(zhuǎn)了LIG 對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護作用。提示LIG 通過下調(diào)DAPK1 表達(dá)對肺炎鏈球菌引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷有保護作用。

綜上，LIG 通過下調(diào)DAPK1 表達(dá)可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，抑制IL-6 表達(dá)，促進IL-10 表達(dá)，對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞有保護作用。