王馨，黃嘉星，潘輝林，馮正富，湯銳明，邱惠思

據(jù)美國癌癥學(xué)會統(tǒng)計(jì)，2020年全球新診斷肺癌220.02萬例，因肺癌死亡的患者有180萬例［1］。根據(jù)組織類型可將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例的85%，其組織學(xué)亞型主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌［2］。據(jù)美國癌癥學(xué)會統(tǒng)計(jì)，肺癌死亡患者中約40%為肺腺癌［3］。目前，肺腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確。6型膠原蛋白α5（COL6A5）含有336個(gè)氨基酸組成的三重螺旋結(jié)構(gòu)，側(cè)翼則包括7個(gè)N末端von Willebrand因子A樣結(jié)構(gòu)域和3個(gè)C末端von Willebrand因子A樣結(jié)構(gòu)域［4］。有研究報(bào)道，COL6A5的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)rs13062453、rs1497305和rs77123808與肺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)［5］，但目前關(guān)于COL6A5在肺腺癌中作用的研究尚少見。本研究擬從數(shù)據(jù)庫、組織標(biāo)本和細(xì)胞層面分析COL6A5在肺腺癌中的表達(dá)模式，探討其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺腺癌細(xì)胞（A549、H1975、H1650、PC9和H1299）均購自中科院上海細(xì)胞所。胎牛血清和1640培養(yǎng)基均購自Gibco公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PowerUp?SYBR?Green預(yù)混液和COL6A5抗體均購自Fermentas公司。RNA extraction kit購自廣州飛揚(yáng)生物有限公司。鋅指轉(zhuǎn)錄因子（ZEB1）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白（Snail）、Twist相關(guān)蛋白1（Twist1）、AlkB家族同源蛋白5（ALKBH5）和β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自Cell Signaling Technology。Magna RIP?RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購自Millipore公司。ALKBH5 shRNA質(zhì)粒和COL6A5過表達(dá)質(zhì)粒均購自廣州復(fù)能生物有限公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher有限公司，熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀及濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)均購自美國BioRad公司，倒置相差顯微鏡購自美國Leica公司。

1.2標(biāo)本收集 收集2013年3月—2018年12月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院胸外科就診的肺腺癌患者27例，其中男16例，女11例，年齡27～91歲，平均（47.90±3.02）歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為肺腺癌，收集患者肺癌組織及配對的癌旁正常組織，于-196℃液氮中保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.3轉(zhuǎn)染 將H1299細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待其融合度為80%時(shí)，將該細(xì)胞以4×104個(gè)/孔接種至6孔板，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜，次日進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。組分1配制：3μg質(zhì)粒（COL6A5過表達(dá)質(zhì)粒、靶向ALKBH5的各個(gè)shRNAs以及各對照質(zhì)粒）和5μL p3000與500μL無血清培養(yǎng)基混合均勻；組分2配制：5μL Lipofectamine 3000加入500μL無血清培養(yǎng)基混合均勻。將組分1和組分2混合，室溫靜置30 min，將上述混合液加入6孔板中，48 h后用于后續(xù)研究。在轉(zhuǎn)染時(shí)，將過表達(dá)COL6A5分為con組（轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒con）和過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染COL6A5）。敲低ALKBH5分為4組：con組（轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒con）、sh-1#組（轉(zhuǎn)染靶向ALKBH5的shRNA片段1質(zhì)粒）、sh-2#組（轉(zhuǎn)染靶向ALKBH5的shRNA片段2質(zhì)粒）和sh-3#組（轉(zhuǎn)染靶向ALKBH5的shRNA片段3質(zhì)粒）。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測mRNA表達(dá) 按照RNA提取和cDNA合成試劑盒的說明書操作，分別提取目標(biāo)細(xì)胞（H1299、H1975、A549、BEAS-2B、H1650和PC9）和目標(biāo)組織（肺腺癌組織及配對癌旁組織）RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。SYBR法用于檢測mRNA表達(dá)，各基因引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：SYBR Mix 10μL，上、下游引物各0.5μL，模板1μL，雙蒸水8μL。反應(yīng)條件：25℃2 min，95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Tab.1 Primer lists in this study表1 qPCR引物序列

1.5Western blot法檢測蛋白的表達(dá)量 將目標(biāo)細(xì)胞H1299、H1975、A549、BEAS-2B、H1650和PC9以7×104個(gè)/孔接種于6孔板，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞1次，每孔加入60μL含有cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰浴10 min。將細(xì)胞收集至離心管中，14 000×g高速離心10 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品上樣量20μg，蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳（100 V恒壓）分離后，200 mA恒流1.5 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗（COL6A5抗體1∶800；E-cadherin抗體1∶1 000；ZEB1抗體1∶1 000；Snail1抗體1∶600；Twist1抗體1∶1 000；ALKBH5抗體1∶500；β-actin抗體1∶5 000）孵育過夜。TBST洗滌3次，每次5 min。分別加入羊抗兔二抗或者羊抗鼠二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。ECL底物發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光，X線膠片顯影。蛋白條帶用Image J進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell小室法檢測細(xì)胞的侵襲能力 將1×105個(gè)細(xì)胞用1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，加入Transwell上室，下室中加入600μL完全培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h后，將小室置于甲醇中固定20 min，棄去小室里面的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦掉小室里面的細(xì)胞及基質(zhì)膠，將小室置于1%結(jié)晶紫中染色10 min，流動水沖掉結(jié)晶紫，風(fēng)干；在顯微鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)侵襲過小室的細(xì)胞。侵襲能力抑制率=（對照組侵襲細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)）/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7RNA甲基化免疫沉淀-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（MeRIPqPCR）實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)錄本上是否存在m6A位點(diǎn) 按照Magna RIP?RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit說明書進(jìn)行MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)。將1×106個(gè)H1299細(xì)胞接種至直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用700μL RIP裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min，14 000×g離心10 min，取上清液作為細(xì)胞裂解物，用wash buffer重懸磁珠，分為IgG組（加入Normal Rabbit IgG抗體）和m6A組（加入anti-m6A抗體），室溫孵育1 h。將上述磁珠/抗體混合物與細(xì)胞裂解液4℃孵育過夜，wash buffer洗滌3次，蛋白酶K處理上述磁珠沉淀，純化RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照1.4中的方法檢測COL6A5mRNA的表達(dá)。

1.8生物信息學(xué)預(yù)測

1.8.1Oncomine Oncomine（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）查詢條件為：“Gene：COL6A5”，“Analysis Type：Cancervs.Normal”，“Cancer Type：Lung Cancer”，“Data Type：mRNA”。探究COL6A5在肺癌中的表達(dá)情況。

1.8.2GEPIA GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）查詢條件為：選 擇“Boxplots”，“gene：COL6A5”，“Datasets Selection：LUAD，點(diǎn)擊add”，點(diǎn)擊“Plot”，即可查詢COL6A5與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.8.3cBioPortal for Cancer Genomics cBioPortal for Cancer Genomics數(shù)據(jù)庫（https：//www.cbioportal.org/）用于查詢與COL6A5表達(dá)相關(guān)的基因。打開數(shù)據(jù)庫，“Select Studies for visualization&Analysis：Lung，LUNG ADENOCARCINOMA”，選擇“l(fā)ung adenocarcinoma（TCGA，PanCancer Altas）”，點(diǎn)擊“Query by Gene：mRNA expression；Entre Genes：COL6A5”，點(diǎn)擊“submit Query”，點(diǎn)擊“Co-expression”，即可查看與COL6A5表達(dá)相關(guān)的基因。

1.8.4SRAMP 進(jìn)入SRAMP網(wǎng)站（http：//www.cuilab.cn/sramp），點(diǎn)擊“Prediction”，輸入COL6A5 mRNA序列，點(diǎn)擊“submit”，即可查詢COL6A5轉(zhuǎn)錄本上潛在的m6A位點(diǎn)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COL6A5在肺腺癌中的表達(dá)模式 在線數(shù)據(jù)庫Oncomine分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，COL6A5在肺癌組織中顯著低表達(dá)，見圖1。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中COL6A5mRNA表達(dá)水平（n=483，0.77±0.09）顯著低于正常組織（n=347，2.61±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.710，P＜0.05）。本研究qPCR結(jié)果亦顯示，肺腺癌組織中COL6A5mRNA表達(dá)水平低于癌旁正常組織（0.97±0.01vs.1.66±0.04，n=27，t=2.220，P＜0.05）。COL6A5mRNA在正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及肺腺癌細(xì)胞A549、H1299、H1975、H1650和PC9中的表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.14±0.01、0.11±0.00、0.11±0.01、0.13±0.02和0.28±0.06，COL6A5mRNA在A549、H1299、H1975、H1650和PC9中的表達(dá)量顯著低于BEAS-2B（n=3，F(xiàn)=192.197，P＜0.01）。

Fig.1 The online databank Oncomine used to measure COL6A5 expression pattern in several kinds of cancers圖1 在線數(shù)據(jù)庫Oncomine分析COL6A5在多種腫瘤中的表達(dá)模式分布圖

Fig.2 The correlation between COL6A5 and prognosis of LUAD patients analyzed by TCGA databank圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析COL6A5與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.2 COL6A5在肺腺癌中的表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，237例肺腺癌患者隨訪0.92～604.00個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為55.83個(gè)月。以COL6A5中位表達(dá)量為界，將肺腺癌患者分為高表達(dá)組119例（≥333.578）和低表達(dá)組118例（＜333.578），高表達(dá)組肺腺癌患者累積總生存率高于低表達(dá)組（Log-rankP=0.013），見圖2。

2.3 ALKBH5下調(diào)COL6A5的表達(dá) 在線軟件SRAMP預(yù)測結(jié)果顯示，COL6A5轉(zhuǎn)錄本上存在多個(gè)m6A位點(diǎn)（圖3A）。本研究MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，m6A組H1299細(xì)胞COL6A5mRNA的相對表達(dá)量顯著高于IgG組（39.03±8.63vs.1.00±0.00，t=7.625，P＜0.01）。qPCR結(jié)果顯示，肺腺癌組織中ALKBH5mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織（3.99±1.33vs.1.66±0.29，t=3.459，P＜0.01）；肺腺癌組織中ALKBH5mRNA與COL6A5mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.599，P＜0.01）。在H1299細(xì)胞中敲低ALKBH5，qPCR結(jié)果顯示，con組、sh-1#組、sh-2#組和sh-3#組ALKBH5mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.00、0.93±0.06、0.22±0.01和0.82±0.07，sh-2#組ALKBH5mRNA表達(dá)水平最低（F=152.400，P＜0.01）；Western blot結(jié)果顯示，con組、sh-1#組、sh-2#組和sh-3#組ALKBH5蛋白條帶灰度值分別為0.334±0.030、0.862±0.005、0.092±0.003和0.434±0.017，sh-2#組對ALKBH5的沉默率達(dá)72.46%（圖3B）。在H1299細(xì)胞中敲低ALKBH5，qPCR結(jié)果顯示，sh-2#組COL6A5mRNA表達(dá)水平明顯高于con組（10.43±2.06vs.1.00±0.00，t=7.940，P＜0.01）；Western blot結(jié)果顯示，sh-2#組COL6A5蛋白表達(dá)水平高于con組（3.592±0.197vs.0.169±0.001，t=30.100，P＜0.01），見圖3C。

2.4 COL6A5抑制肺腺癌細(xì)胞增殖 通過cBioPortal在線數(shù)據(jù)庫下載與COL6A5共表達(dá)的基因，KEGG分析發(fā)現(xiàn)COL6A5可能參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、止 血（hemostasis）和細(xì)胞表面相互作用（cell surface interaction）等生命活動，見圖4A。在H1299細(xì)胞中過表達(dá)COL6A5，Transwell結(jié)果顯示，COL6A5過表達(dá)組發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)目少于con組（275±24vs.581±37，t=9.629，P＜0.01），見圖4B。COL6A5過表達(dá)組E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，ZEB1、Snail1和Twist1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，見圖4C、表2。

Fig.3 The effect of ALKBH5 on COL6A5 analyzed by bioinformatics combined with experiments圖3 生物信息學(xué)分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ALKBH5對COL6A5的調(diào)控作用

3 討論

挖掘數(shù)據(jù)庫信息對探索肺腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究具有重要作用［6-8］。有研究通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫確定了分泌型磷酸化蛋白1（SPP1）在肺腺癌中高表達(dá)，且其表達(dá)量與肺腺癌患者預(yù)后差呈正相關(guān)（P=0.017）［9］。在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)8個(gè)B7家族配體和CD28家族受體（B7-CD28家族基因）與肺腺癌患者預(yù)后有關(guān)［10］。從TCGA數(shù)據(jù)庫中分析到聚合酶ε（POLE）突變能夠提高肺腺癌患者的總體生存率［11］。但是，與程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）低表達(dá)的POLE突變患者相比，PD-L1高表達(dá)的POLE突變肺腺癌患者總體生存率較高［11］。有研究者從在線數(shù)據(jù)庫The Human Protein Altas中提取了基因數(shù)據(jù)集，通過一系列生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有絲分裂紡錘體相關(guān)標(biāo)志物驅(qū)動蛋白成員15（KIF15）、有絲分裂檢查點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸激酶（BUB1）、細(xì)胞周期蛋白B2（CCNB2）、細(xì)胞周期依賴性激酶1（CDK1）、驅(qū)動蛋白成員4A（KIF4A）、Discs大同源物關(guān)聯(lián)蛋白5（DLGAP5）、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2癌基因（ECT2）和苯胺素（ANLN）可以作為預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)［12］。研究人員從在線數(shù)據(jù)庫Oncomine以及后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，序列相似性為83%的家族成員A（FAM83A）在肺腺癌中顯著高表達(dá)，且FAM83A高表達(dá)與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者預(yù)后有關(guān)［13］。本研究通過Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，COL6A5基因在肺腺癌中低表達(dá)；經(jīng)qPCR驗(yàn)證，COL6A5在肺腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)量均遠(yuǎn)低于癌旁正常組織及正常肺上皮細(xì)胞。

Fig.4 Focusing the effect of COL6A5 on the invasion ability of LUAD cells圖4 COL6A5對肺腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Tab.2 Comparison of the expression of EMT biomarkers between the two groups表2 COL6A5過表達(dá)組與對照組EMT標(biāo)志物的表達(dá)比較 （±s）

Tab.2 Comparison of the expression of EMT biomarkers between the two groups表2 COL6A5過表達(dá)組與對照組EMT標(biāo)志物的表達(dá)比較 （±s）

＊P＜0.05

組別對照組COL6A5過表達(dá)組t n 3 3 E-cadherin mRNA 1.00±0.00 7.39±1.63 7.423＊蛋白0.132±0.001 1.923±0.218 19.310＊ZEB1 mRNA 1.00±0.00 0.18±0.09 16.820＊蛋白1.097±0.014 0.634±0.005 53.080＊Snail1 mRNA 1.00±0.00 0.20±0.12 12.710＊蛋白0.314±0.008 0.016±0.002 6.190＊Twist1 mRNA 1.00±0.00 0.39±0.03 39.950＊蛋白1.532±0.182 0.849±0.127 49.890＊

目前，關(guān)于COL6A5在腫瘤中的研究較少，且主要集中在突變功能上。有研究報(bào)道，在遺傳性大腸癌中COL6A5可發(fā)生突變，但是否與大腸癌發(fā)生有關(guān)及其如何在大腸癌中發(fā)揮功能尚未明確［14］。有研究者統(tǒng)計(jì)TCGA數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，COL6A5在食管鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，且COL6A5低表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)［15］；也有學(xué)者統(tǒng)計(jì)了GSE84846數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)COL6A5與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后有關(guān)［16］；但是上述2個(gè)研究僅從不同數(shù)據(jù)庫分析信息，未行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測到COL6A5可能參與調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的EMT表型、止血和細(xì)胞表面相互作用等生命活動，并通過Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)COL6A5能夠抑制H1299細(xì)胞發(fā)生侵襲；qPCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)COL6A5可明顯抑制EMT標(biāo)志物，增加上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，提示COL6A5通過調(diào)控H1299細(xì)胞的EMT表型來抑制其侵襲能力。

近年來，廣泛存在于真核細(xì)胞的RNA甲基化（m6A修飾）調(diào)控備受關(guān)注。m6A修飾能夠影響mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，最終參與細(xì)胞分化、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞對應(yīng)激的反應(yīng)等生命活動。在這種修飾系統(tǒng)中，m6A編碼器由核心催化成分甲基 轉(zhuǎn) 移 酶 樣3（METTL3）/甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶 樣14（METTL14）組成，以插入m6A修飾［17］。ALKBH5和脂肪與肥胖相關(guān)蛋白（FTO）被稱為m6A銷碼器，可去除基因轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾［18］。m6A位點(diǎn)由m6A讀碼器（含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和IGF2BPs）執(zhí)行［19］。本研究通過生物信息學(xué)及實(shí)驗(yàn)證實(shí)，COL6A5轉(zhuǎn)錄本上存在m6A修飾位點(diǎn)，且ALKBH5調(diào)控COL6A5表達(dá)，但是該系統(tǒng)中的讀碼器尚未明確，這將是本課題組下一步研究的內(nèi)容。另外，COL6A5如何調(diào)控細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物，進(jìn)而影響細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，尚有待進(jìn)一步研究。在后續(xù)研究中，本課題組將通過免疫共沉淀聯(lián)合蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)尋找COL6A5的作用靶標(biāo)，以揭示其抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制。