黃尚寶 石永杰 黃思聰

1 廣東省信宜市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 525300； 2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科

全球原發(fā)性肝癌年新發(fā)病數(shù)達(dá)84.1萬人，我國新發(fā)病例及死亡率分別達(dá)全球55.4%及53.9%，我國肝癌5年生存率僅為12.1%，其中HCC占原發(fā)性肝癌類型的85%～90%[1]。由于缺乏特異性標(biāo)志物和臨床癥狀隱匿，大多數(shù)HCC患者確診時(shí)已為 晚期，80%以上患者預(yù)后較差[2]。AFP是HCC最常用的篩查指標(biāo)，但近30%的HCC患者AFP水平正常[3]。因此，尋求新的HCC早期診斷標(biāo)志物一直是近年學(xué)界研究的熱點(diǎn)。IQGAP3基因位于一個(gè)癌癥高發(fā)擴(kuò)增的染色體部位1q21.3，既往研究[4-5]證明IQGAP3促進(jìn)HCC的生長、侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥，且發(fā)現(xiàn)IQGAP3表達(dá)與患者的5年生存率負(fù)相關(guān)，提示IQGAP3具有成為HCC診斷標(biāo)記物的潛力。本研究收集HCC患者全血樣本，進(jìn)一步分析全血IQGAP3 mRNA表達(dá)對(duì)HCC的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本與分組 實(shí)驗(yàn)所用的41例HCC患者外周血標(biāo)本來自2018—2021年到信宜市人民醫(yī)院及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診的患者，HCC患者入組條件：(1)按原發(fā)性肝癌診療規(guī)范診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)病理科活檢并明確診斷為HCC的患者；(2)經(jīng)病歷及檢驗(yàn)系統(tǒng)資料查詢未發(fā)現(xiàn)患者曾于上述兩醫(yī)院行放療、化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)與HCC同時(shí)合并其他癌癥；(2)確診為HCC但已接受過治療的患者；(3)妊娠。另選取30例健康體檢者為對(duì)照組，分別使用無添加劑管及EDTA抗凝管采集實(shí)驗(yàn)對(duì)象靜脈血3～6ml，EDTA抗凝管加入等體積Trizol后于-80℃保存。Trizol試劑購自美國賽默飛公司。

1.2 實(shí)時(shí)熒光PCR

1.2.1 相關(guān)儀器及試劑：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI7500，全血總RNA抽提試劑購自北京天根公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green qPCR Master Mix購自Fermentas公司，DL10,000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker和DL600 DNA Marker全部購買于中國Takara公司，IQGAP3、GAPDH引物及Random primer則由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物列表

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：取每個(gè)樣本總RNA溶液及Random primer各2μg，DEPC水補(bǔ)齊至11μl。充分混勻，瞬時(shí)離心后放置于PCR儀中，經(jīng)過70℃反應(yīng)5min后立即取出放置冰上。加入混合物14μl/管(5×RT Buffer 5μl，dNTPs 2μl，M-MLV Rever 1μl，Transcriptase RNA aseinhibitor 0.5μl，DEPC水5.5μl)，輕彈充分混勻后瞬時(shí)離心，放置于PCR儀中，37℃孵育60min，70℃滅活5min后16℃無限循環(huán)，取出-20℃凍存cDNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR：用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照比例(上游引物0.25μl，下游引物0.25μl，SYBRGreenmix 5μl，cDNA 0.2μl，ddH 204.3μl)配制反應(yīng)體系(10μl)，瞬時(shí)離心置PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性95℃，60s；變性94℃，30s；退火50℃，30s；延伸72℃，45s；循環(huán)次數(shù)40次，72℃再次延伸10min；依據(jù)2-ΔΔCT算法分析熒光定量PCR結(jié)果。

1.3 血清AFP檢測 取健康者及HCC患者全血2 970×g 10min后取上層血清，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程使用化學(xué)發(fā)光法檢測血清AFP，0.98～8.78μg/L為正常參考區(qū)間，儀器與試劑分別為ABBOTT I2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者全血IQGAP3 mRNA表達(dá)增高 Shapiro-Wilk檢驗(yàn)顯示HCC組41例患者(P=0.008)及對(duì)照組30例健康體檢者(P<0.001)全血IQGAP3 mRNA表達(dá)均不服從正態(tài)分布。Mann-Whitney檢驗(yàn)顯示HCC組全血IQGAP3 mRNA表達(dá)[39.08(11.58～55.65)]顯著高于對(duì)照組[2.30(1.24～6.00)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖1。

圖1 HCC患者全血IQGAP3 mRNA表達(dá)增高

2.2 全血IQGAP3 mRNA與HCC患者臨床資料的關(guān)系 Shapiro-Wilk檢驗(yàn)顯示HCC患者年齡組不服從正態(tài)分布(P=0.021)，TNM分期組、性別組、HBsAg定性組呈正態(tài)分布(P>0.05)。HCC患者全血IQGAP3 mRNA表達(dá)在TNM分期組別間有顯著差異(P<0.01)，在年齡、性別、HBsAg定性組別間無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 IQGAP3表達(dá)水平與臨床病例因數(shù)的相關(guān)性

2.3 全血IQGAP3 mRNA表達(dá)聯(lián)合血清AFP對(duì)HCC的診斷價(jià)值 Spearman分析顯示HCC患者全血IQGAP3 mRNA表達(dá)與血清AFP正相關(guān)(r=0.713，P<0.01)。診斷HCC，單獨(dú)使用全血IQGAP3 mRNA及AFP診斷的ROC曲線下面積分別為0.903(95%可信區(qū)間0.834～0.971)及0.813(95%可信區(qū)間0.712～0.913)；兩者聯(lián)合的ROC曲線下面積為0.855(95%可信區(qū)間0.770～0.940)，高于單獨(dú)使用AFP(Z=2.181，P=0.029 2)，見圖2。

圖2 各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)HCC診斷的ROC曲線下面積

3 討論

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因，AFP在體內(nèi)可促進(jìn)細(xì)胞生長，逃避宿主對(duì)肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)測，是與預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但在HCC患者中，只有33%～65%直徑<3cm的腫瘤血清AFP水平升高[7]，盡管AFP作為篩查肝癌的生物標(biāo)志物有其局限性，但仍是應(yīng)用最廣泛的生物標(biāo)志物[3,8]。因此，識(shí)別新的生物標(biāo)志物對(duì)HCC的診斷和預(yù)后評(píng)估以及了解其腫瘤發(fā)生的潛在機(jī)制至關(guān)重要。

IQGAP家族包含IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3，進(jìn)化上高度保守，在癌細(xì)胞的誘導(dǎo)、抑制及進(jìn)展起著關(guān)鍵的作用[9]。IQGAP3位于癌癥基因擴(kuò)增的熱點(diǎn)1q22，在肝臟等器官中限制表達(dá)；作為一種多功能支架蛋白，QGAP3通過與多種蛋白質(zhì)的相互作用在多種癌癥中調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲[10-12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)IQGAP3高表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，進(jìn)而增加HCC的侵襲力，與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良正相關(guān)[4]，同時(shí)能增加肝癌細(xì)胞的腫瘤干性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC患者全血IQGAP3 mRNA表達(dá)明顯高于正常健康人，進(jìn)一步論證了IQGAP3具有作為新的HCC標(biāo)志物的潛力。而在分析IQGAP3表達(dá)與臨床資料的相關(guān)性中發(fā)現(xiàn)，IQGAP3表達(dá)與HCC患者TNM分期相關(guān)，受年齡、性別等因素影響較小，一定程度上體現(xiàn)了IQGAP3對(duì)HCC篩查的應(yīng)用價(jià)值。本研究分析雖然顯示HCC患者是否攜帶HBsAg對(duì)IQGAP3表達(dá)無影響，但所得的統(tǒng)計(jì)值較小，可能與樣本數(shù)較少有關(guān)，因此乙肝相關(guān)的HCC患者全血IQGAP3 mRNA表達(dá)是否存在差異值得進(jìn)一步考究。

同時(shí)，本研究結(jié)果顯示HCC患者全血IQGAP3 mRNA表達(dá)與AFP水平正相關(guān)。通過ROC曲線分析，筆者發(fā)現(xiàn)全血IQGAP3 mRNA與AFP聯(lián)合檢測對(duì)HCC診斷的ROC曲線下面積優(yōu)于單獨(dú)使用血清AFP。提示IQGAP3能作為一個(gè)新分子標(biāo)記物在HCC的篩查中與AFP互補(bǔ)，下一步筆者將擴(kuò)大研究樣本數(shù)，繼續(xù)探索IQGAP3能否預(yù)測HCC患者的生存期及臨床應(yīng)用價(jià)值。