綿陽師范學(xué)院 冀紅柳

隨著我國國民肉類消耗的增加，畜禽養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大帶來的糞便污染問題日益嚴(yán)重[1]。畜禽糞便不僅會(huì)對(duì)海陸空造成污染，同時(shí)也會(huì)引起畜禽乃至人類的一些疾病[2]。但從資源的角度看待糞便，其中又含有巨大的價(jià)值，糞便經(jīng)合理處理后可作為肥料、飼料及能源等[3]。本文綜合閱讀近年來關(guān)于堆肥微生物研究的文獻(xiàn)，對(duì)各種方法進(jìn)行了總結(jié)分類，初步總結(jié)了目前糞便堆肥微生物的研究方法。

一、糞便堆肥微生物的組成

糞便堆肥的過程分為初期、高溫期、降溫期，在不同的堆肥時(shí)期，各種微生物相互交替演變、繁殖生長，共同作用完成堆肥過程。

（一）細(xì)菌

細(xì)菌菌群為糞便堆肥整個(gè)過程的優(yōu)勢(shì)菌群，堆肥初期嗜溫細(xì)菌為主要菌群，隨著溫度的上升，細(xì)菌菌群也在不斷演變。

（二）真菌

真菌對(duì)溫度很敏感，最適溫度在25-30℃，多數(shù)真菌為嗜溫真菌，比如曲霉和木霉等。

（三）放線菌

放線菌對(duì)纖維素、半纖維素有一定的降解能力，在高溫下可以孢子形式存活，所以抗逆性比真菌更好。

二、影響糞便堆肥微生物作用效果的主要因素

糞便堆肥進(jìn)程的速度及效果受微生物的作用影響。微生物的生長繁殖、消耗合成等過程會(huì)被很多因素所影響，包括CN、PH值、含水量、通氣量、溫度等，這些因素可升高或降低微生物合成酶的速度、微生物代謝快慢等。

（一）溫度

在糞便的堆肥過程中，溫度是一個(gè)重要指標(biāo)。我國《農(nóng)業(yè)廢棄物無害化處理標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，需要在55℃條件下持續(xù)3天以上或50-55℃條件下5-7天，才能滿足無害化處理要求。為了保證堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量，堆體的溫度最好維持在45-65℃。

（二）通氣量

不論是糞便的好氧堆肥還是厭氧堆肥，通氣量都是一個(gè)很重要的因素。主要影響兩個(gè)方面：第一，適當(dāng)?shù)耐饬繋ё叨洋w中過多的溫度，溫度超過68℃會(huì)影響嗜熱菌群的活性。第二，通氣量不達(dá)標(biāo)就會(huì)造成厭氧環(huán)境，從而影響好氧堆肥進(jìn)程。

（三）C/N

C/N是堆肥過程中評(píng)價(jià)堆肥程度的一個(gè)重要指標(biāo)。有機(jī)C是微生物生長的重要能量來源，通過微生物作用將糞便中的一些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為CO2和腐殖質(zhì)。有機(jī)N是微生物的營養(yǎng)來源，一部分被微生物吸收作為營養(yǎng)，一部分轉(zhuǎn)化為惡臭氣體的主要來源氨氣，剩余的絕大部分進(jìn)行了硝化作用。C/N需要保持一定的比例，有機(jī)C過高會(huì)導(dǎo)致微生物對(duì)堆體降解的時(shí)間過長，有機(jī)N過高不利于微生物的生長繁殖，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量惡臭氣體等。堆肥初始C/N一般保持在20-35。

（四）PH值

在堆肥過程中，認(rèn)為PH值一般保持為7.0~7.5，這個(gè)范圍適合微生物的生長繁殖，有利于糞便堆肥的進(jìn)行。酸性環(huán)境可減少N以氨氣的形式損失，提高N含量，有利于堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量。

（五）含水量

水是很重要的載體，糞便堆肥微生物所需很多營養(yǎng)物質(zhì)都需要溶于水才能被分解吸收。含水量不適宜會(huì)影響微生物生長代謝繁殖，含水量過高會(huì)造成堆肥縫隙被填滿以致氧氣循環(huán)受阻、產(chǎn)生酸臭味，導(dǎo)致養(yǎng)分損失及環(huán)境二次污染，含水量不足時(shí)會(huì)影響微生物對(duì)有機(jī)物的分解吸收，造成堆體發(fā)酵不充分。

三、不同方法對(duì)堆肥微生物及其效果的研究現(xiàn)狀

（一）傳統(tǒng)稀釋培養(yǎng)分離法

傳統(tǒng)的稀釋分離培養(yǎng)是根據(jù)需分離培養(yǎng)微生物的性質(zhì)來選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)的，然后用顯微鏡來觀察菌類的形態(tài)特征、生理生化特征及數(shù)量來研究環(huán)境微生物的多樣性。

（二）磷脂脂肪酸甲酯法（PLFA）

磷脂脂肪酸作為生物標(biāo)記，可以定量地分析菌群數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，具有應(yīng)用范圍廣，適用于土壤、水、腐殖質(zhì)等微生物中的檢測；可迅速處理多種樣品；精準(zhǔn)測量樣品中生物量；避免傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法引起的計(jì)數(shù)不足等問題。但同時(shí)此方法也有不足之處，首先，對(duì)磷脂脂肪酸的掌握不充分，不能把檢測到的數(shù)據(jù)與微生物對(duì)應(yīng)；其次，無法將生物群落組成與功能相聯(lián)系；最后，磷脂脂肪酸的合成與微生物的生長繁殖環(huán)境密切相關(guān)，比如濕度、溫度、PH等。

（三）分子生物學(xué)技術(shù)

研究微生物的多樣性一般是直接從環(huán)境樣品中提取DNA或RNA，然后對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增再采用多種技術(shù)來鑒定比如說變性梯度凝膠電泳 、末端限制性片段長度多態(tài)性以及高通量測序等。PCR片段擴(kuò)增采用的目的片段一般選擇相對(duì)保守又能區(qū)分不同菌群的，例如細(xì)菌一般采用16S rRNA，具有的優(yōu)點(diǎn)為多拷貝、多信息、長度適中等。近些年來分子生物學(xué)不斷地成熟與發(fā)展，加速我們更深層次更全面的了解糞便堆肥微生物。我們希望基于分子生物學(xué)來獲得糞便堆肥微生物的種類和多樣性、特定時(shí)間活躍的菌群以及功能及潛在功能。常用的一些技術(shù)包括但不限于DGGE、T-RFLP、高通量測序、宏組學(xué)、單細(xì)胞水平研究等方法。

1.變性梯度凝膠電泳（DGGE）

DGGE是研究微生物采用最早的分子生物學(xué)技術(shù)，具有分辨率高、成本低、應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是會(huì)被DNA的提取、PCR的擴(kuò)增乃至引物設(shè)計(jì)等過程影響而測量分析的微生物群落豐度要>1%。

2.末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）

限制性長度多態(tài)性（RFLP）是由于糞便堆肥過程中出現(xiàn)的不同微生物種群基因不同，具有各自的限制性酶切位點(diǎn)，利用DNA酶進(jìn)行酶切后電泳會(huì)產(chǎn)生各自相應(yīng)的條帶，可利用這些條帶進(jìn)行群落多樣性、結(jié)構(gòu)和重組質(zhì)進(jìn)行內(nèi)切酶酶切后，會(huì)出現(xiàn)4-6條片段，增加了鑒定的復(fù)雜性，因此這種方法適用于分析微生物群落的不同階段。為了彌補(bǔ)這些不足，在RFLP基礎(chǔ)上對(duì)PCR擴(kuò)增過程中的末端特異性引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，再進(jìn)行后續(xù)酶切、電泳等操作，即末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）。

3.高通量測序

高通量測序具有通量大、準(zhǔn)確率高、操作相對(duì)簡單等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物的檢測分析。最常用的方法是利用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)對(duì)樣品的16S rRNA的相關(guān)區(qū)域分析。采用高通量分析技術(shù)，對(duì)豬糞高溫堆肥的初始階段、高溫階段、腐熟階段樣品的16S rDNA V4～V5 可變區(qū)序列進(jìn)行測序分析，在升溫期和高溫期優(yōu)勢(shì)門均為厚壁菌門，而腐熟期優(yōu)勢(shì)門為放線菌門，該方法準(zhǔn)確分析豬糞堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替，為堆肥過程添加外源菌劑促進(jìn)堆肥過程的進(jìn)行提供了理論依據(jù)。

4.宏組學(xué)

宏組學(xué)是指宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)及宏蛋白組學(xué)等。宏基因組是特定環(huán)境樣品中的全部基因，這種研究方法的研究對(duì)象為真菌和細(xì)菌基因組的DNA，解決了環(huán)境樣品中大部分微生物不能分離培養(yǎng)的難題。宏基因組學(xué)無法在特定的環(huán)境下表達(dá)微生物群落基因的變化，而宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)彌補(bǔ)了這一問題。宏轉(zhuǎn)錄組是在特定的環(huán)境、時(shí)空中微生物全部轉(zhuǎn)錄體的總和。

5.單細(xì)胞水平研究

我們已經(jīng)能夠從群落水平認(rèn)識(shí)微生物的分類、結(jié)構(gòu)組成等方面，但一直很難從單細(xì)胞水平認(rèn)識(shí)群落中的微生物。隨著單細(xì)胞水平的研究逐漸深入，我們從最初的放射自顯影技術(shù)（Microautoradiography，MAR） 到 現(xiàn) 如今拉曼光譜學(xué)顯微技術(shù)（Raman spectroscopy，Raman）以及納米二次離子質(zhì) 譜（Nano-scale secondary ion mass spectrometry，nanoSIMS)，后兩者分辨力非常高，可達(dá)到納米級(jí)別。

四、結(jié)語

微生物在糞便堆肥及資源化利用過程中有著十分重要的地位。在微生物群落演替，不同菌類的作用效果、發(fā)現(xiàn)更加高效的菌類和研制新型外源微生物添加劑，都離不開對(duì)微生物的研究。在傳統(tǒng)微生物研究方法的基礎(chǔ)，隨著分子生物學(xué)的不斷更迭發(fā)展，對(duì)微生物擁有了更加深層次的認(rèn)識(shí)。另外，在研究過程中我們不能只局限于一種方法，各種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)選擇合適的研究方法與技術(shù)相組合。

相關(guān)鏈接

微生物包括：細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它個(gè)體微小，與人類關(guān)系密切。涵蓋了有益跟有害的眾多種類，廣泛涉及食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保、體育等諸多領(lǐng)域。在我國教科書中，將微生物劃分為以下8大類：細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體。有些微生物是肉眼可以看見的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝、香菇等。還有微生物是一類由核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的“非細(xì)胞生物”。肉眼難以看清，需要借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌和少數(shù)藻類等。（但有些微生物是肉眼可以看見的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝等。）病毒是一類由核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的“非細(xì)胞生物”，但是它的生存必須依賴于活細(xì)胞。根據(jù)存在的不同環(huán)境分為空間微生物、海洋微生物等，按照細(xì)胞結(jié)構(gòu)分類分為原核微生物和真核微生物。一個(gè)體積恒定的物體，被切割的越小，其相對(duì)表面積越大。微生物體積很小，如一個(gè)典型的球菌，其體積約1mm3，可是其表面積卻很大。這個(gè)特征也是賦予微生物其他如代謝快等特性的基礎(chǔ)。

相比于大型動(dòng)物，微生物具有極高的生長繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鐘內(nèi)繁殖1次。不妨計(jì)算一下，1個(gè)大腸桿菌假設(shè)20分鐘分裂1次，1小時(shí)3次，1晝夜24小時(shí)分裂24×3=72次，大概可產(chǎn)生4722366500萬億個(gè)（2的72次方），這是非常巨大的數(shù)字。但事實(shí)上，由于各種條件的限制，如營養(yǎng)缺失、競爭加劇、生存環(huán)境惡化等原因，微生物無法完全達(dá)到這種指數(shù)級(jí)增長。 已知大多數(shù)微生物生長的最佳pH范圍為7.0 (6.6-7.5)附近，部分則低于4.0。