沙巍

世界衛(wèi)生組織(WHO)2020年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，中國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)約83.3萬(wàn)，約占全球8.4%，居全球第三位，其中，僅47%通過(guò)病原學(xué)證實(shí)，低于全世界57%的檢出率[1]。早期診斷、早期干預(yù)是切斷結(jié)核病傳播的最重要的手段之一，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用于結(jié)核病早期診斷的快速檢測(cè)技術(shù)紛紛涌現(xiàn)。2013年WHO修訂了結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，推薦將GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)和TB-LAMP技術(shù)陽(yáng)性檢出結(jié)果視同于細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性，作為病原學(xué)陽(yáng)性結(jié)核病的診斷依據(jù)[2]；我國(guó)也將分子生物學(xué)檢測(cè)作為結(jié)核病病原學(xué)檢查的手段之一寫入了《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》中[3]。根據(jù)分子生物學(xué)檢測(cè)的技術(shù)原理，目前國(guó)際和國(guó)內(nèi)較為成熟的檢測(cè)方法和產(chǎn)品包括：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的Xpert，采用恒溫?cái)U(kuò)增的LAMP和SAT，采用探針雜交的Hain和微陣列芯片技術(shù)，采用熔解曲線的MeltPro TB以及對(duì)DNA或RNA擴(kuò)增后測(cè)序法的宏基因組檢測(cè)等。這些分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在醫(yī)院、疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、體檢機(jī)構(gòu)和其他生物檢測(cè)機(jī)構(gòu)中廣泛開展，形形色色的產(chǎn)品讓臨床醫(yī)生的可選擇范圍大大增加，在處理疑難病例時(shí)更為得心應(yīng)手。然而，技術(shù)的進(jìn)步也帶來(lái)了困惑，在眾多的檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)該如何針對(duì)不同患者選擇診斷效能高、成本效益佳的單項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)或者多項(xiàng)技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)，是目前亟待解決的問題。針對(duì)此問題，筆者提出以下建議。

一、知曉各種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)原理和過(guò)程

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)用于感染性疾病的診斷自20世紀(jì)初開始逐漸推廣應(yīng)用于臨床，自單基因到多基因檢測(cè)，直至目前的多組學(xué)、高通量技術(shù)的應(yīng)用，為疑難、危重感染性疾病的快速診斷和患者救治提供了強(qiáng)有力的支撐。病原微生物在進(jìn)化的過(guò)程中，同種微生物的某些種特異性的基因序列高度保守，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)這些序列進(jìn)行擴(kuò)增，并采用不同的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)即可診斷待檢樣本中是否含有目標(biāo)病原菌。此外，對(duì)于藥物作用靶位點(diǎn)的基因突變的檢測(cè)，可用于細(xì)菌耐藥性的預(yù)判，是現(xiàn)今分子藥敏檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展的理論基礎(chǔ)[4-6]。

結(jié)核病的分子檢測(cè)的靶標(biāo)主要有16SrRNA、16SrRNA和23SrRNA間的間隔區(qū)ITS、插入序列IS6110，以及hsp65、gryB和rpoB基因等[7-9]。WHO推薦的結(jié)核病及其耐藥性的快速檢測(cè)技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、Xpert、線性探針等，我國(guó)也批準(zhǔn)了包括核酸恒溫?cái)U(kuò)增、探針熔解曲線及基因芯片技術(shù)等自主研發(fā)的產(chǎn)品。這些技術(shù)或檢測(cè)的靶標(biāo)不同，或檢測(cè)的技術(shù)不同，或針對(duì)的樣本不同，熟悉這些技術(shù)的檢測(cè)原理，知曉其反應(yīng)的過(guò)程，包括核酸擴(kuò)增的方法、靶序列的獲取、信標(biāo)的產(chǎn)生和讀取等，均有助于我們對(duì)于分子生物學(xué)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行解讀。

Xpert技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一。其采用的GeneXpert檢測(cè)平臺(tái)，半巢式PCR擴(kuò)增rpoB基因的192 bp長(zhǎng)度的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性序列，其中包含了81 bp的利福平耐藥決定區(qū)域(RRDR)序列。該區(qū)域用5個(gè)分子信標(biāo)(探針A到E)進(jìn)行探測(cè)，探針為寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。這五條探針使用了不同的染料和淬滅劑進(jìn)行標(biāo)記；探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的探針被切斷，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離產(chǎn)生熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的循環(huán)閾值(Ct值)和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。當(dāng)5個(gè)探針中至少2個(gè)探針陽(yáng)性才表明結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性，可進(jìn)一步根據(jù)Ct值進(jìn)行半定量分析，Ct值≤16為高荷菌量，Ct值16～22為中荷菌量，Ct值22～28為低荷菌量，Ct值>28為極低荷菌量。如果RRDR存在突變，抑制了與一個(gè)或多個(gè)rpoB特異性分子信標(biāo)的雜交，減少或消除了相應(yīng)探針的信號(hào)，熒光信號(hào)會(huì)減弱或消失。了解了Xpert的操作原理，臨床醫(yī)生在解讀報(bào)告的時(shí)候就會(huì)了解不同陽(yáng)性程度分級(jí)的原因及判斷是否耐藥的信號(hào)原理，有助于分析一旦出現(xiàn)臨床診斷、表型藥敏檢測(cè)和基因型檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)可能的原因。

除了以Xpert為典型代表的熒光定量PCR技術(shù)外，LAMP和實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增(SAT)技術(shù)是在恒定溫度的情形采用特定的方法對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，前者針對(duì)gyrB和IS6110基因，后者針對(duì)16SRNA。線性探針和基因芯片則是通過(guò)特殊標(biāo)記的探針與特異擴(kuò)增的靶序列雜交形成雙鏈分子來(lái)檢測(cè)序列的變化，例如GenoType MTBDR等。宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)通過(guò)對(duì)臨床樣本的DNA或RNA進(jìn)行鳥槍法測(cè)序，可以同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物。

二、掌握不同分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的診斷效能

任何一種臨床檢測(cè)試劑或方法，在上市之前都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)，對(duì)其診斷效能進(jìn)行評(píng)價(jià)，獲批進(jìn)入臨床應(yīng)用后也會(huì)面臨大量樣本的檢驗(yàn)。臨床應(yīng)用者應(yīng)關(guān)注其診斷效能的各項(xiàng)指標(biāo)，了解其應(yīng)用于不同患者、不同樣本和不同情形下的敏感度、特異度和準(zhǔn)確性。

系統(tǒng)綜述的結(jié)果顯示，Xpert在所有肺結(jié)核患者中檢測(cè)的敏感度和特異度分別為85%和98%，其中，對(duì)痰涂片陰性肺結(jié)核檢測(cè)的敏感度和特異度分別為67%和98%；對(duì)于肺外標(biāo)本，包括腦脊液、淋巴結(jié)組織、胸腔積液等檢測(cè)的敏感度和特異度以培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)分別為：70%和97%、89%和86%、50%和99%；以臨床診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)分別為：41%和99%，81%和90%，19%和99%。對(duì)于所有肺結(jié)核患者利福平耐藥檢測(cè)的敏感度和特異度分別為96%和98%[10]。

LAMP的檢測(cè)效能較Xpert略遜。一項(xiàng)對(duì)應(yīng)用TB-LAMP檢測(cè)呼吸道樣本效能的系統(tǒng)綜述結(jié)果顯示，其檢測(cè)敏感度約為89.6%，特異度為94%[11]。對(duì)肺外結(jié)核樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，以臨床診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)敏感度為77%，特異度為99%；以培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)敏感度為93%，特異度為77%[12]。

mNGS在結(jié)核病，尤其是疑難和重癥結(jié)核病、肺外結(jié)核的診斷中也發(fā)揮了一定的作用，在有限的臨床研究中均顯示了較好的數(shù)據(jù)。一項(xiàng)前瞻性的小樣本臨床研究結(jié)果顯示，mNGS對(duì)所有活動(dòng)性結(jié)核病檢測(cè)的敏感度為44%，與Xpert相似(42%)，但遠(yuǎn)高于常規(guī)方法(29%)[13]。

從這些文獻(xiàn)資料可見，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，分子生物學(xué)檢測(cè)方法的檢測(cè)效能大為提高，檢測(cè)準(zhǔn)確性也有保障。當(dāng)然，數(shù)據(jù)也顯示，目前沒有一種技術(shù)可以全覆蓋、百分之百準(zhǔn)確地檢測(cè)出所有的病原，無(wú)論是臨床研究的結(jié)果還是真實(shí)世界的數(shù)據(jù)所提供的各種效能參數(shù)，都是臨床醫(yī)生為特定的患者選擇適合的檢查手段用于診斷疾病的參考依據(jù)，也是分析解讀檢測(cè)結(jié)果與患者臨床表現(xiàn)的相符程度所需要的經(jīng)驗(yàn)依據(jù)。

三、了解分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性的原因

分子生物學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)是對(duì)微生物的核酸進(jìn)行特異性的體外擴(kuò)增和特異性的比對(duì)檢測(cè)，因此，具有所需樣本量少、精確度高、所需時(shí)間短及不依賴于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是，分子生物學(xué)檢測(cè)也存在所需技術(shù)要求高、操作不當(dāng)和實(shí)驗(yàn)室污染會(huì)造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果、寄殖的正常菌群及死亡的病原體的DNA也同樣可被復(fù)制等問題。這些問題會(huì)對(duì)分子生物學(xué)檢測(cè)的結(jié)果造成干擾，并且其結(jié)果也不能用于疾病治療效果的評(píng)定。

對(duì)于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法中，Xpert的正確率高，操作簡(jiǎn)單，全程自動(dòng)化設(shè)計(jì)，最大程度減少了實(shí)驗(yàn)室工作人員的工作量，更符合生物安全的需求；但是其對(duì)儀器設(shè)備的要求高，價(jià)格較昂貴。LAMP的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器的依賴程度較小，而且試劑成本較低，在基層實(shí)驗(yàn)室具有一定的使用價(jià)值，但是高溫、濕度、試劑量不足和樣品之間的交叉污染都會(huì)導(dǎo)致其檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。SAT的優(yōu)點(diǎn)在于以RNA為靶標(biāo)，檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果等同于結(jié)核分枝桿菌活菌的存在，但是RNA易降解，且其技術(shù)操作較為復(fù)雜。mNGS雖然可涵蓋絕大多數(shù)的微生物的檢測(cè)，但是其需特殊的儀器，檢測(cè)價(jià)格昂貴，對(duì)于基因文庫(kù)的要求較高，且對(duì)于真菌和分枝桿菌等厚壁細(xì)菌需要破壁前處理，否則就會(huì)影響到這些細(xì)菌的檢測(cè)陽(yáng)性率。

此外，雖然對(duì)于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)從理論上說(shuō)如果樣本中存在一個(gè)目標(biāo)微生物的靶基因序列就可以擴(kuò)增并進(jìn)行檢測(cè)，然而在實(shí)踐中任何一種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)都有其最低檢測(cè)限。例如，Xpert的最低檢測(cè)限為131 CFU/ml[14]，其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)為101～103CFU/ml[15]。此外，由于分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)的是核苷酸序列，如果結(jié)核分枝桿菌的耐藥是由于靶序列外的突變導(dǎo)致或者是氨基酸的“無(wú)義突變”，也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的誤判。例如，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Xpert的局限性包括：(1)無(wú)法檢測(cè)出利福平的異質(zhì)性耐藥；(2)對(duì)于C533G的突變位點(diǎn)的檢出率不高；(3)在菌量較少的情況下，探針D和E在實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生信號(hào)的延緩會(huì)導(dǎo)致耐藥的假陽(yáng)性結(jié)果；(4)錯(cuò)誤地將rpoB的F514F的沉默突變檢測(cè)為利福平耐藥[9]。

四、熟讀國(guó)家結(jié)核病控制規(guī)劃要求和國(guó)內(nèi)外相關(guān)指南

2017年發(fā)布的《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》明確提出了規(guī)劃目標(biāo)：2020年我國(guó)的肺結(jié)核發(fā)病和死亡人數(shù)進(jìn)一步減少，全國(guó)肺結(jié)核發(fā)病率下降到58/10萬(wàn)以下。也提出了具體的指標(biāo)，如肺結(jié)核患者病原學(xué)陽(yáng)性率達(dá)到50%以上，耐多藥肺結(jié)核高危人群耐藥篩查率達(dá)到95%以上?！吨袊?guó)結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020年版)》也建議對(duì)所有痰涂片陰性的疑似結(jié)核病患者都要進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，對(duì)于病原學(xué)陽(yáng)性的患者要進(jìn)行耐藥篩查，優(yōu)先采用分子藥敏檢測(cè)技術(shù)，如對(duì)利福平耐藥，則需進(jìn)行異煙肼和二線抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè)。WHO和我國(guó)的相關(guān)指南對(duì)于診斷結(jié)核病和診斷耐藥性的各項(xiàng)技術(shù)的規(guī)范使用也進(jìn)行了推薦[16-17]。對(duì)于已在臨床開始使用但是在結(jié)核病研究領(lǐng)域尚未有研究或者實(shí)踐數(shù)據(jù)的新技術(shù)，尤其是高通量的技術(shù)，則需要對(duì)這些規(guī)范有充分的了解。例如，《高通量宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識(shí)》[18]的建議：對(duì)于危急重癥、疑難感染、群體性感染事件等，可考慮作為一線檢測(cè)方法；傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法未能給出明確病原學(xué)結(jié)果從而影響患者準(zhǔn)確診療的感染性疾病、新發(fā)突發(fā)傳染病、驗(yàn)證常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果或排除其他發(fā)熱疾?。煌扑]臨床通過(guò)擬診先行傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)及PCR檢測(cè)擬診疑似常見病原微生物，不盲目使用mNGS技術(shù)。

2020年我國(guó)已基本完成《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》的目標(biāo)[19]，2021年是“十四五”開局第一年，距離實(shí)現(xiàn)聯(lián)合國(guó)“2030年可持續(xù)發(fā)展議程”結(jié)核病控制目標(biāo)和“2035年終止結(jié)核病流行”目標(biāo)只剩下10年和15年的時(shí)間，廣大的結(jié)核病防治戰(zhàn)線的同仁們?cè)诜e極防控新型冠狀病毒肺炎疫情的同時(shí)也仍舊奮戰(zhàn)在抗結(jié)核戰(zhàn)役的第一線。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是我們戰(zhàn)勝結(jié)核病的強(qiáng)有力的武器，需要因地施策和規(guī)范應(yīng)用才能切實(shí)發(fā)揮功效[20]，為降低患者疾病負(fù)擔(dān)，不應(yīng)盲目尋求新方法、撒網(wǎng)式檢查。還要注意的是，在使用先進(jìn)的診斷技術(shù)時(shí)，不能忽略經(jīng)典的結(jié)核病微生物學(xué)檢查，需要將兩者緊密結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短。