范湘宜，汪曌，陳冬

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧 錦州 121000;2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海 200000)

過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種主要由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的鼻粘膜炎性疾病[1]。全球超過(guò)5億人患有過(guò)敏性鼻炎，AR可使人們產(chǎn)生打噴嚏、流鼻涕、鼻塞和鼻瘙癢等癥狀，甚至誘發(fā)過(guò)敏性哮喘，嚴(yán)重影響人們的日常生活[2]。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為過(guò)敏性鼻炎的免疫學(xué)機(jī)制主要由Th1/Th2細(xì)胞的失衡造成，Treg及Th17等輔助性T細(xì)胞也參與其中[3]，但具體機(jī)制尚不明確。最近，一種能夠分泌白細(xì)胞介素10(IL-10)抑制炎癥反應(yīng)的特定的B細(xì)胞亞群被發(fā)現(xiàn)，被稱為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞[4]。其可以通過(guò)產(chǎn)生IL-10、TGF-β、BAFF等有調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，或通過(guò)細(xì)胞間直接接觸的方式來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[5]。但調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在AR中的具體作用機(jī)制鮮有報(bào)道。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)敏性鼻炎患者外周靜脈血Breg細(xì)胞的比例，探討B(tài)reg細(xì)胞的變化在AR中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院對(duì)塵螨過(guò)敏的AR患者，AR的診斷依據(jù)《變應(yīng)性鼻炎及其對(duì)哮喘的影響》(ARIA)指南[6],即具有陣發(fā)性打噴嚏、鼻癢、流清水樣鼻涕和鼻塞等典型癥狀，且血清特異性IgE(sIgE)檢測(cè)塵螨陽(yáng)性。納入標(biāo)準(zhǔn)：年滿18歲；進(jìn)行過(guò)sIgE檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)哮喘、鼻息肉、鼻竇炎等癥狀；1個(gè)月內(nèi)曾患呼吸道感染疾?。唤?周內(nèi)服用過(guò)抗過(guò)敏藥物者；患結(jié)核、肝炎等傳染性疾病及其他全身性疾病。同時(shí)招募無(wú)上述典型臨床癥狀且sIgE陰性的志愿者作為對(duì)照。每名患者及志愿者均需簽署知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并備案。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

FcR阻斷劑(Human TruStain FcX)、APC/Cy7偶聯(lián)抗人CD19抗體(APC-Cy7 CD19)、PE/Cy7偶聯(lián)抗人 CD24抗體(PE-Cy7 CD24)、PerCp/Cy5.5偶聯(lián)抗人CD27抗體(Percp-Cy5.5 CD27)均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。FACS Verse(3-laser,8color)流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 分組及臨床標(biāo)本收集

AR患者作為實(shí)驗(yàn)組(AR 組)，健康志愿者作為對(duì)照組(HC組)。每名患者和健康對(duì)照者均抽取3 mL EDTA抗凝外周血，混勻抗凝，2 h內(nèi)處理。

1.4 方法

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD19+CD24+CD27+Breg細(xì)胞占CD19+Breg細(xì)胞的百分比

采集AR患者和健康對(duì)照者3 mL外周靜脈血于EDTA抗凝管中，應(yīng)用Ficoll法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，加入Human TruStain FcX震蕩均勻，室溫避光孵育15 min。分別加入APC/Cy7偶聯(lián)抗人CD19抗體、PE/Cy7偶聯(lián)抗人 CD24抗體、PerCp/Cy5.5偶聯(lián)抗人CD27抗體，輕輕震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。采用1×PBS清洗，室溫1400 rpm洗滌5 min，棄上清。加1×PBS重懸至300 μL進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照、各熒光抗體單標(biāo)對(duì)照組，所有對(duì)照組樣本按照熒光抗體標(biāo)記樣本操作流程依次進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，流式數(shù)據(jù)分析及代表圖采用Flowjo(version 10.6)，統(tǒng)計(jì)作圖采用GraphPad Prism(version 6.0)。HC組和AR組年齡差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，健康人和AR患者性別差異采用χ2檢驗(yàn)。健康人和AR患者之間Breg細(xì)胞含量用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)比較(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))：取P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

通過(guò)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)及sIgE檢測(cè)篩選出30例塵螨過(guò)敏的AR患者(AR組)和30例健康對(duì)照者(HC組)。AR組平均年齡(41.37±10.53)歲，HC組平均年齡(40.90±13.45)歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.882)；AR患者(男/女：18/12)和健康對(duì)照者(男/女：13/17)間性別差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.301)，見(jiàn)表1。

表1 AR組和HC組的臨床資料比較

2.2 AR組與HC組外周血中CD19+CD24+CD27+Breg細(xì)胞比例比較

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)AR組和HC組外周血中CD19+CD24+CD27+Breg細(xì)胞占CD19+B細(xì)胞的百分比(見(jiàn)圖1)。AR組Breg(CD19+CD24+CD27+)細(xì)胞百分比(中位值M=17.95%)較HC組(中位值M=24.66%)降低(P<0.01，見(jiàn)圖2)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 AR組與HC組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較匯總表

A：門內(nèi)包含所有的外周血淋巴細(xì)胞；B：門內(nèi)包含所有的CD19+B細(xì)胞；C(HC組)和D(AR組)：門內(nèi)包含所有的Breg(CD19+CD24+CD27+)細(xì)胞

圖2 HC組與AR組外周血中CD19+CD24+CD27+Breg細(xì)胞百分比的比較

3 討 論

過(guò)敏性鼻炎是由多種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、神經(jīng)肽和細(xì)胞等形成的一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)共同體，引起鼻黏膜高反應(yīng)。過(guò)敏性疾病的發(fā)病機(jī)制紛繁復(fù)雜，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子或細(xì)胞間的直接接觸來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的B細(xì)胞被稱為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞[7]。但是目前Breg細(xì)胞在AR中的研究甚少，具體機(jī)制尚不清楚。Breg細(xì)胞表面標(biāo)志復(fù)雜多樣，目前尚無(wú)特異性表面標(biāo)志，并且不斷有新的Breg細(xì)胞亞群被發(fā)現(xiàn)。迄今為止，已經(jīng)描述了具有許多表型和效應(yīng)子功能相似性的多個(gè)人類和小鼠的Breg細(xì)胞亞群，包括B10細(xì)胞，CD5+B1a細(xì)胞、CD5+CD1dhiB細(xì)胞、CD19+CD138+漿母細(xì)胞、CD1dhiCD5+CD19+B細(xì)胞、CD19+CD24+CD38+B細(xì)胞及CD19+CD24+CD27+B細(xì)胞等，在人類中主要是CD19+CD24+CD38+和CD19+CD24+CD27+兩大類Bregs細(xì)胞[8]。經(jīng)過(guò)大量文獻(xiàn)檢索及閱讀，發(fā)現(xiàn)在過(guò)敏性疾病中對(duì)CD19+CD24+CD27+Breg的研究較多，因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是CD19+CD24+CD27+Breg細(xì)胞亞群在AR外周血的比例變化。

Breg細(xì)胞在自身免疫疾病性疾病模型中具有調(diào)節(jié)功能，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者Breg細(xì)胞數(shù)量減少并伴有功能的減弱，與活動(dòng)程度呈負(fù)相關(guān)。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的Breg細(xì)胞失去了抑制Th17細(xì)胞的分化和將幼稚T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的能力[9]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD19+CD24hi+CD27+Breg細(xì)胞水平明顯下降，經(jīng)藥物治療后，CD19+CD24hi+CD27+Breg細(xì)胞水平明顯增加[10]。在對(duì)多發(fā)性硬化患者的研究中發(fā)現(xiàn)，其Breg細(xì)胞明顯低于健康人，且與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，疾病越重 Breg細(xì)胞比例越低[11]。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞通過(guò)控制各種效應(yīng)細(xì)胞的比例和功能來(lái)減少免疫反應(yīng)的發(fā)展，因此越來(lái)越受到關(guān)注。

過(guò)敏性疾病亦存在免疫失衡，在過(guò)敏性小鼠模型研究中證明，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞可以通過(guò)foxp3陽(yáng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)防和逆轉(zhuǎn)過(guò)敏性氣道炎癥[12]。此外，AR鼠黏膜中Breg細(xì)胞比例低于正常對(duì)照組小鼠，提示在AR發(fā)生發(fā)展中，Breg細(xì)胞起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Breg的增多可能通過(guò)抑制Th2反應(yīng)來(lái)抑制AR的癥狀[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AR患者外周血中CD19+CD24+CD27+Breg細(xì)胞比例明顯低于HC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.251，P<0.01)，與以上研究結(jié)果相似，提示Breg細(xì)胞在AR發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

Breg細(xì)胞能抑制效應(yīng)T細(xì)胞如Th1和Th17細(xì)胞分化，同時(shí)促進(jìn)Treg細(xì)胞擴(kuò)增，參與Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡的調(diào)節(jié)，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化。這些效應(yīng)除了由分泌細(xì)胞因子如IL-10、IL-35等介導(dǎo)外，還可以通過(guò)細(xì)胞之間膜結(jié)合分子包括PD-1、Fas、MHC-II、CTLA-4、ICOS等介導(dǎo)[14]。本實(shí)驗(yàn)雖發(fā)現(xiàn)AR患者外周血中 Breg 細(xì)胞的比例減少，但參與其免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)因子有哪些以及具體的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。