許放，王洪新，郭斌

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121000)

透明質(zhì)酸(hyaluronic，HA)是一種由葡糖醛酸和N—乙酰氨基葡糖的雙糖單位重復連接構(gòu)成的酸性黏多糖。HA通過降解可以得到O-HA，酶解法是制備透明質(zhì)酸寡糖最溫和的降解方法[1]。HA寡糖是相對分子質(zhì)量<10 000、單糖殘基數(shù)為2～40(一般為4～16)的HA分子片段[2]，屬于小分子多糖，其性質(zhì)與普通透明質(zhì)酸有很大不同，甚至具有完全相反的作用。其生物活性主要有促血管生成、促進創(chuàng)傷愈合、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等。目前有關(guān)透明質(zhì)酸寡糖在傷口愈合中的作用研究較少，本研究通過形態(tài)學及組織學的觀察，證實了透明質(zhì)酸寡糖對傷口愈合的作用，為透明質(zhì)酸寡糖的臨床應用提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物：新西蘭大耳白兔，2～3 kg錦州醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑：透明質(zhì)酸寡糖(純度≥95%，分子量758.63)，山東省藥學科學實驗室自制。液體石蠟，天津市大茂試劑廠。硬脂酸，天津永晟精細化工有限公司。黃凡士林，南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司。十二烷基硫酸鈉，天津市光復精細化工研究所。丙三醇，天津永晟精細化工有限公司。尼泊金甲酯，浙江圣效化學品有限公司。羊毛脂，三乙醇胺，天津市致遠化學試劑有限公司。TGF-β一抗，即用型SABC--POD二抗試劑盒，DAB顯色試劑盒武漢博士德生物工程有限公司。積雪苷霜軟膏(國藥準字Z3102056，批號20180731，上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 軟膏制備方法

1.2.1.1 軟膏基質(zhì)篩選[3-4]

表1 軟膏基礎處方篩選

1.2.1.2 正交試驗因素與水平的確定：由以上實驗得出結(jié)論，配方2為最適宜軟膏基質(zhì)。根據(jù)文獻和預實驗結(jié)果[5]，確定考察因素為單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、液體石蠟，選用L9(33)正交表進行試驗。評價指標[6]分別為軟膏的外觀(占總分的40%)，分層時間(占總分的20%)，耐寒耐熱穩(wěn)定性(占總分的20%)。按照正交試驗結(jié)果確定軟膏基質(zhì)處方為試驗7。正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗設計與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

1.2.1.3 制備工藝：取黃凡士林2.00 g、硬脂酸2.10 g、單硬脂酸甘油酯1.60 g、液狀石蠟2.50 g水浴加熱至75 ℃，制成油相，再取甘油2.00 g、十二烷基硫酸鈉0.20 g、尼泊金甲酯0.02 g、蒸餾水9.60 mL加熱至85 ℃，制成水相，將透明質(zhì)酸寡糖0.06 g加入水相，攪拌使溶解。然后將水相混合液緩緩加到油相緩沖液中，邊加邊攪拌，冷凝，即得透明質(zhì)酸寡糖軟膏。

1.2.2 藥效學分析方法

1.2.2.1 動物模型制作[7]：將新西蘭大耳白兔經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，麻醉顯效后，剔除毛發(fā)，常規(guī)消毒，于每只兔耳腹側(cè)面同一部位畫出直徑為1 cm的圓，并切除圓內(nèi)皮膚，保留軟骨膜及軟骨。

造模后每只實驗動物肌注青霉素4000 U，每日1次，注射2次。造模后即開始用藥，12只動物隨機分成6組，每組2只，分別涂以透明質(zhì)酸寡糖軟膏高濃度、中濃度、低濃度、積雪苷霜軟膏、基質(zhì)，其中每組有1只兔耳作為空白對照。傷口每天酒精消毒后換藥，每日3次，每只兔分籠飼養(yǎng)。

1.2.2.2 傷口愈合評價[8-9]：其中6只兔分別于造模當天及造模后的第3、7、14天，對各個創(chuàng)面進行拍照，以圖像分析軟件Image-pro-plus 4.5處理圖片，得出每個傷口愈合面積，從而計算傷口愈合率，傷口愈合率 =〔(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積〕×100%。剩余6只兔分別于建模后的第3、7、14天，創(chuàng)傷組織局部取材，常規(guī)固定、包埋、切片經(jīng) HE 染色。

1.2.2.3 免疫組織化學染色：應用SABC免疫組織化學方法，石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min后進行高壓抗原修復。滴加5%封閉血清孵育10～15 min，甩去，不需洗滌。兔抗兔TGF-β1、生物素標記的山羊抗兔二抗工作液37 ℃孵育10～30 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，步驟同上。每組切片隨機抽取8個高倍鏡視野(×400)，用 Image-ProPlus Version 6.0圖像分析軟件測定平均光密度值，取均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 實驗創(chuàng)面肉眼觀察

造模后各組創(chuàng)面見少量滲血，第1、2天，各組創(chuàng)面均無明顯變化，創(chuàng)面周圍略腫。第4天，空白對照組仍無明顯變化，有少量滲出液。各濃度透明質(zhì)酸寡糖軟膏組及陽性藥物組出現(xiàn)淡黃色分泌物，創(chuàng)面出現(xiàn)收縮。第7天，高濃度透明質(zhì)酸寡糖組創(chuàng)面紅潤，創(chuàng)周結(jié)痂，創(chuàng)面收縮速度明顯快于其他組，空白組傷口收縮不明顯。第14天，各濃度透明質(zhì)酸寡糖軟膏組及陽性藥物組創(chuàng)面干燥，創(chuàng)周有輕微瘢痕，其中高濃度組創(chuàng)面愈合面積明顯大于其他組，空白組創(chuàng)面邊緣有收縮，但仍有大部分未愈合。

2.2 創(chuàng)面愈合率 見表4。

表4 各組各時間點傷口愈合率比較

2.3 組織學觀察

造模后第1、2天，6組傷口肉芽組織增生較少，6組之間比較未見明顯差異。造模后第7天，高濃度透明質(zhì)酸寡糖軟膏組肉芽組織增生程度明顯高于其他組，空白組上皮增生不明顯，造模后第14天，各濃度透明質(zhì)酸寡糖組及陽性藥物組有較多肉芽組織形成，創(chuàng)面內(nèi)可見大量新生血管生長，新生組織細胞排列緊密，空白組表皮仍有缺損，高濃度透明質(zhì)酸寡糖組愈合效果優(yōu)于其他組，見圖1。

高濃度組(第14天) 中濃度組(第14天) 低濃度組(第14天)

2.4 TGF-β蛋白質(zhì)免疫組化結(jié)果

TGF-β蛋白質(zhì)陽性表達胞漿呈現(xiàn)棕黃色。高、中、低濃度組、陽性藥物組和基質(zhì)組TGF-β蛋白質(zhì)平均光密度值比較差異具有統(tǒng)計學意義，說明高、中、低濃度組、陽性藥物組對創(chuàng)面愈合都有作用。TGF-β在第14天表達最高，基質(zhì)組略有TGF-β蛋白質(zhì)陽性表達，但和空白組比較，無顯著性差異，排除了空白組對創(chuàng)面愈合的干擾，見表5、圖2。

表5 各組TGF-β蛋白質(zhì)免疫組化結(jié)果

高濃度組(第14天) 中濃度組(第14天) 低濃度組(第14天)

3 討 論

由于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、交通業(yè)及體育事業(yè)的高速發(fā)展，各種事故所造成的創(chuàng)傷日趨增多。創(chuàng)傷不僅發(fā)生率高，而且程度差別很大，傷情可以嚴重而復雜，甚至危及傷員的生命。創(chuàng)傷同心血管疾病及癌癥已成為目前造成死亡的三大原因，如何有效促進傷口愈合是當今醫(yī)學界亟待解決的問題。本研究主要是考察透明質(zhì)酸寡糖在制備成軟膏劑型后在傷口愈合方面的功效。

傷口愈合是一個復雜的過程，涉及多種細胞以及生長因子的相互作用,包括炎癥階段，增殖階段，組織重塑階段[10]。其中TGF-β的作用受到越來越多的重視。

對于皮膚缺損模型，在造模后肌注青霉素屬常規(guī)預防操作，青霉素本身對傷口愈合無作用，對各實驗組無影響。傷口愈合過程伴隨著肉芽組織增生及傷口面積的減小，通過測量傷口面積的大小，計算傷口愈合率可以評價其對傷口愈合作用的快慢[11]。本研究通過比較3種不同濃度的透明質(zhì)酸寡糖軟膏組、陽性藥物組、基質(zhì)組以及空白組的傷口愈合率，可以看出在傷口愈合早期(1～2 d),各組間差異不明顯，創(chuàng)面以充血為主。在傷口愈合中期(5～7 d)，透明質(zhì)酸高濃度組的傷口愈合明顯快于其他組，可能與透明質(zhì)酸寡糖促進血管生成的作用有關(guān)[12]。在傷口愈合后期，空白組的愈合速度明顯慢于其他組。

通過組織學的觀察，在傷口愈合中期，不同濃度的透明質(zhì)酸寡糖組及陽性藥物組肉芽組織增生較多，新生血管增多，這是促進傷口愈合的原因。通過此研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸寡糖軟膏確實有促進傷口愈合的作用。