柳先知，翟亞莉，陳冬

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧 錦州 121000；2.商丘市第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南 商丘 476000)

過(guò)敏性鼻炎(AR)是指機(jī)體接觸過(guò)敏原后由免疫球蛋E(IgE)為主要介導(dǎo)的鼻部變態(tài)反應(yīng)性疾病，主要表現(xiàn)有鼻塞、鼻癢、連續(xù)性打噴嚏及大量水樣涕[1]。目前AR的全球患病率約為10%～25%，對(duì)人們的生活質(zhì)量及健康產(chǎn)生重大影響，已成為各國(guó)亟待解決的全球性社會(huì)問(wèn)題。AR主要是一種 I 型變態(tài)反應(yīng)性疾病，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為T(mén)h1/Th2細(xì)胞免疫失衡在AR的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[2]，而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其他輔助性T細(xì)胞如Th17 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在以Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)的過(guò)敏性炎癥中也發(fā)揮了重要作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡[3]。

程序性死亡受體-1(programmed cell death-l，PD-1)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的B7-CD28 超家族的一員，主要是負(fù)性共刺激信號(hào)，對(duì)T細(xì)胞的失活及凋亡狀態(tài)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，可以直接抑制致病性效應(yīng)T細(xì)胞[4]。有研究表明Th17細(xì)胞數(shù)量受其表面因子調(diào)控，PD-1是其中最重要的負(fù)性調(diào)控因子之一，PD-1負(fù)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞，其在自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病中發(fā)揮致病作用[5-6]。然而關(guān)于Th17細(xì)胞表面的PD-1的表達(dá)變化在AR中研究甚少。

本研究旨在應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1在Th17細(xì)胞表面的表達(dá)水平及Th17的細(xì)胞比例變化，研究AR中Th17 細(xì)胞的變化情況及其表面PD-1表達(dá)水平的變化。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的過(guò)敏性鼻炎患者30例為實(shí)驗(yàn)組，健康者20例為對(duì)照組，所選研究對(duì)象需符合以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)同意備案。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)AR組：符合中國(guó)過(guò)敏性鼻炎診治指南(2018年)[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)敏性鼻炎患者；(2)HC組：不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的健康人員。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個(gè)月內(nèi)患有呼吸道感染性疾病者；(2)近2周內(nèi)服用過(guò)免疫抑制劑、抗組胺藥或糖皮質(zhì)激素等抗過(guò)敏藥物者；(3)患結(jié)核、肝炎等傳染性疾病、嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾病及其他全身性疾病者。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

Cell Activation Cocktail(withBrefeldin A)，APC-Cy7 anti-human CD4，Brilliant Violet 421 anti-human IL-17A，Brilliant Violet 510 anti-human CD127(IL-7Ra)，PE anti-human CD279(PD-1)，PE Mouse IgG1 κisotype Ctrl，APC Mouse IgG1 κ isotype Ctrl以上試劑均購(gòu)自美國(guó)Biolegend有限公司。FACS Verse(3-laser,8color)流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 密度梯度離心法分離PBMC：患者和健康對(duì)照者均抽取2 mL EDTA抗凝外周血，混勻抗凝。將外周靜脈血應(yīng)用密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),對(duì)PBMC進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 PD-1標(biāo)記的Th17細(xì)胞(CD4+IL-17A+)的熒光抗體染色：標(biāo)記流式管，加入PBMC懸液100 μL，各流式管分別加入3 μL Fc Receptor Blocking Solution，室溫避光孵育15 min。管中以2 μL/mL分別計(jì)算加入細(xì)胞刺激劑Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)，于37 ℃，5% CO2環(huán)境孵育5 h。孵育結(jié)束后，取出各流式管，分別加入APC-Cy7-anti-humanCD4，PE-anti-human PD-1各5 μL，輕彈管壁混勻，室溫避光孵育15 min。孵育結(jié)束后加入1 mL 1×PBS重懸細(xì)胞，室溫1400 rpm×5 min洗滌1次，棄上清液。分別加入200 μL 1×Cytofix/Cytoperm，4 ℃ 孵育20 min。結(jié)束后加入1 mL Perm/Wash重懸細(xì)胞，室溫3000 rpm ×5 min洗滌1次，棄上清。加入BV421-anti-human IL-17A 抗體，4 ℃避光30 min。結(jié)束后加入1 mL 1×PBS，室溫1400 rpm×5 min洗滌1次，棄上清液。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

四色標(biāo)記樣本檢測(cè)之前，需設(shè)置空白對(duì)照、各熒光抗體單標(biāo)對(duì)照組和同型對(duì)照，對(duì)照組包括：(1)空白對(duì)照：不加任何熒光抗體；(2)APC-Cy7-anti-humanCD4單標(biāo)：只加入 APC-Cy7-anti-humanCD4 熒光抗體；(3)BV421-anti-human IL-17A單標(biāo)：只加入BV421-anti-human IL-17A 熒光抗體；(4)PE-anti-human PD-1 單標(biāo)：只加入 PE-anti-human PD-1 熒光抗體；(5)同型對(duì)照：PD-1的同型抗體PE Mouse IgG1 κ isotype Ctrl，余抗體正常添加(所有對(duì)照組樣本按照四色標(biāo)記樣本操作流程依次進(jìn)行)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 AR組與HC組的臨床資料比較

AR組中男性為12例，女性為18例；HC組中男性為8例，女性為12例，年齡均在15～68歲，兩組在年齡及性別方面的比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 AR組和HC組的臨床資料比較

2.2 AR組與HC組外周血中Th17細(xì)胞的比例變化

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) AR組和HC組外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量百分比。AR組 Th17(CD4+IL-17A+)細(xì)胞百分比(中位值M=2.51%)較 HC 組(中位值M=1.13%)升高(P<0.001，圖1)。

·為數(shù)據(jù)離群值

2.3 PD-1在AR組和HC組外周血Th17細(xì)胞表面的表達(dá)

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) AR組和HC組外周血中Th17細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平，與HC健康對(duì)照組相比，AR患者中Th17細(xì)胞表面PD-1表達(dá)降低(Z=-5.941，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。典型流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、表2。

表2 HC組與AR組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較匯總表

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD4+ IL-17A+ T 細(xì)胞占 CD4+ T細(xì)胞的百分比，PD-1+的CD4 + IL-17A + Th17 細(xì)胞分別占 CD4 +IL-17A +Th17細(xì)胞總數(shù)的百分比；A：P1 門(mén)內(nèi)包含所有的外周血淋巴細(xì)胞；B：P2門(mén)內(nèi)包含所有的CD4+T細(xì) 胞；C(HC組)和D(AR組)：P3門(mén)內(nèi)包含所有的Th17(CD4+ IL-17A+)細(xì)胞；E(HC組)：為PD-1+ Th17(CD4+ IL-17A+)細(xì)胞占Th17(CD4+ IL-17A+)細(xì)胞的百分比；F(AR組)：PD-1+Th17(CD4+ IL-17A+)細(xì)胞占 Th17(CD4+ IL-17A+)細(xì)胞的百分比

圖3 PD-1在Th17細(xì)胞表達(dá)水平的比較

2.4 在AR組中進(jìn)行PD-1與Th17細(xì)胞的Sperman相關(guān)性分析

AR患者中PD-1與Th17(圖4，r=-0.623，P<0.001)細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)。

圖4 PD-1與Th17細(xì)胞百分比的相關(guān)散點(diǎn)圖

3 討 論

過(guò)敏性鼻炎被認(rèn)為是各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、神經(jīng)肽，以及粘附分子和細(xì)胞等形成的一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)共同體，而引起的特異性、非特異性的鼻黏膜高反應(yīng)的變應(yīng)性疾病。經(jīng)典研究認(rèn)為T(mén)h1和Th2細(xì)胞應(yīng)答的免疫失衡是變應(yīng)性氣道炎癥的發(fā)病機(jī)理的中心[8]。新近發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞是區(qū)別于Th1和Th2 細(xì)胞的不同亞型，在過(guò)敏及自身免疫性疾病的免疫失衡中發(fā)揮重大作用。有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度增加的Th17細(xì)胞數(shù)目或Th17功能過(guò)度活化將激發(fā)變應(yīng)性疾病(包含過(guò)敏性鼻炎和哮喘)的發(fā)生與發(fā)展[9]，我們的研究結(jié)果也證明在Th17細(xì)胞在AR發(fā)病機(jī)制中有著至關(guān)重要的作用，進(jìn)一步觀察了Th17細(xì)胞表面的PD-1在AR患者外周血中的表達(dá)變化，為闡明AR患者Th17細(xì)胞免疫失衡的調(diào)控因子提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

AR實(shí)驗(yàn)組中Th17細(xì)胞比例增加和過(guò)度活化。既往研究表明，Th17細(xì)胞是具有優(yōu)先合成IL-17家族細(xì)胞因子(尤其是IL-7A和IL-17E)的新型CD4+T亞型，它們被認(rèn)為在炎性疾病的發(fā)病機(jī)理中起著至關(guān)重要的作用[10-11]。Liu Y等人的研究結(jié)果表明在卵清蛋白或屋塵螨誘導(dǎo)的AR鼠模型的鼻灌洗液中，發(fā)現(xiàn)IL-17A水平和Th17細(xì)胞頻率升高[12]。這些發(fā)現(xiàn)表明Th17細(xì)胞免疫失衡與AR發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

本研究證實(shí)在AR中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，其表面PD-1表達(dá)降低，PD-1表達(dá)水平與Th17細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，PD-1為負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)免疫耐受系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。Th17細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平下降，可導(dǎo)致PD-1對(duì)Th17細(xì)胞增殖的抑制作用減弱，即Th17細(xì)胞增殖能力增加，導(dǎo)致其分泌的細(xì)胞因子產(chǎn)生變化，引起免疫功能失衡[13]。因此，在AR中，存在Th17細(xì)胞免疫失衡以及PD-1表達(dá)異常。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AR患者外周血中PD-1 在Th17 細(xì)胞表面的表達(dá)水平明顯減少。而這一研究結(jié)果同L Yang研究的自身免疫性關(guān)節(jié)炎結(jié)果相似，其研究還觀察到PD-1與配體結(jié)合后，通過(guò)抑制PI3K/AKT通路的活性抑制Th17的免疫應(yīng)答功能[14]。McAlees[15]對(duì)哮喘小鼠模型的研究中，在阻斷PD-1后，可以增加Th17細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而增加了動(dòng)物模型的氣道高反應(yīng)性。在過(guò)敏性哮喘中發(fā)現(xiàn)Th1、Th17分化主要由mTORC1支持，T細(xì)胞的活化遵循經(jīng)典的mTOR途徑并且依賴(lài)PI3K/AKT路徑，因此，PD-1可能通過(guò)直接抑制mTORC1而影響Th17細(xì)胞的分化[16-17]。

我們推測(cè)Th17細(xì)胞表面的PD-1作為共刺激因子參與AR的發(fā)病機(jī)制，但是其具體作用機(jī)制還不甚清楚，仍需做進(jìn)一步探究。