隨家寧，陳海燕，馮婷，李芳嬋*，蔣林，2，3*，黃婉清，農(nóng)麗惠（.廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200；3.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，南寧 530200）

三方益子方由三個古代經(jīng)典名方加減化裁而來，由鹽益智、鹽補骨脂、烏藥、金櫻子、酒覆盆子、酒黃精、枸杞子、桑葚、芡實、酒蓯蓉和炙甘草11味藥組成，具有暖腎祛寒、溫脾養(yǎng)肝、縮尿止遺的功效。臨床以湯劑應(yīng)用多年，療效明顯，由于復方成分復雜，為保證臨床應(yīng)用湯劑能充分發(fā)揮出原有的臨床療效和安全性，將古人的臨床用藥經(jīng)驗與現(xiàn)代工藝技術(shù)相結(jié)合[1]，即以水為溶媒提取，確保安全性和臨床療效的一致性[2]。

目前“整體觀思想”是破解中藥質(zhì)控碎片化，突破重圍的重要指導[1]，采用多指標成分評價提取工藝可滿足本方物質(zhì)基礎(chǔ)的整體性[3]。中藥復方有“多成分、多靶點”的特點，為遵循復方制劑“整體”概念，借鑒特征圖譜分析手段，可較好地體現(xiàn)復方中各類成分與療效的相關(guān)性。得膏率和藥效成分是中藥提取最常用的評價指標[3]，藥效成分是藥物發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，最大限度地提取藥效成分可保證臨床療效及提高用藥效率[4]。因此選擇特征圖譜、主要藥效成分、得膏率為考察指標，確定各項工藝參數(shù)。另外，對多指標合理的綜合評價，直接影響著提取工藝參數(shù)的確定，各個評價因素的權(quán)重系數(shù)的確定又是科學、合理地作出評價的基礎(chǔ)[5]，層次分析法（AHP）是一種主觀結(jié)合客觀的評價方式，經(jīng)其確定各指標的權(quán)重增強了評價結(jié)果的合理性和科學性。

故本研究在傳統(tǒng)水提取的基礎(chǔ)上，對三方益子方有效組分進行提取工藝優(yōu)選并驗證，得到最佳提取工藝參數(shù)，為處方的制劑工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，型號：Anglient 1260 Ⅱ）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500E）；SQP分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；超純水儀一體機（廣西南寧市博美生物科技有限公司，型號：Direct-Q5UV）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號：DZF-6090）。

1.2 試藥

鹽益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）、鹽補骨脂（Psoralea corylifoliaL.）、烏藥（Lindera aggregata（Sims）kosterm.）、酒 黃 精（Polygonatum sibiricμmRed.）、酒覆盆子（Rubus chingiiHuu）、金櫻子（Rosa LaevigataMichx.）、枸杞子（Lycium barbarumL.）、桑葚（MorusalbaL .）、芡實（Euryale feroxSalisb.）、酒蓯蓉（C.tubulosa（Schenk）Wight）、炙甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）均購自南寧市華泰中藥飲片有限責任公司，均由廣西中醫(yī)藥大學朱意麟老師鑒定為正品；原兒茶酸（批號：RP190605，純度≥99.99%）、補骨脂素（批號：RP190515，純度≥99.99%）、異補骨脂素（批號：RP190423，純度≥99.95%）、甘草酸（批號：RP190517，純度≥99.34%）（成都麥德生科技有限公司）；乙腈（色譜級，美國Thermo Fisher Scientific公司）；磷酸（分析純，成都金山化學試劑有限公司，批號：20190606）；甲醇（分析純，成都市科隆化學品有限公司，批號：2020102902）。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提濃縮液樣品的制備

按照處方比例的5倍量稱取處方藥材，按8倍、6倍、6倍加水量，2 h、1 h、1 h的提取時間，提取3次，合并藥液，濃縮至500 mL，置于4℃冰箱保存，備用。

2.2 特征圖譜研究

2.2.1 色譜條件 采用Agilent 5 TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈（B）-0.2%磷酸（A）為流動相；梯度洗脫（0～5 min：5%～7%B；5～12 min：7%～15%B；12～26 min：15%～40%B；26～35 min：40%～50%B；35～45 min：50%～85%B；45～60 min：85%B），流 速1.0 mL·min－1，柱 溫30℃；進樣量10 μL；檢測波長（0～18.5 min：260 nm；18.5～21 min：300 nm；21～30 min：350 nm；30～60 min：252 nm）。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項下樣品5 mL于蒸發(fā)皿中，揮干，精密加入25 mL甲醇轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，稱定重量，超聲30 min，待冷卻后，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，即得。

2.2.3 各單味藥溶液的制備 按處方比例稱取各單味藥，按“2.2.2”項下方法制得各單味藥材供試品溶液。

2.2.4 特征圖譜的建立及相似度評價 按照“2.2.1”項下色譜條件，按“2.2.2”項下方法制備10批次供試品溶液進行測定，記錄圖譜。將10個圖譜導入“中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012年版），以S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 s，通過多點校正后，采用中位數(shù)相關(guān)系數(shù)法進行圖譜自動匹配，生成10批次樣品共有模式圖譜，確定了19個共有峰，并建立對照圖譜（R），結(jié)果見圖1，計算相似度，結(jié)果見表1。10批三方益子方的相似度均在0.982以上，表明不同批次間樣品相似度良好。

表1 相似度評價結(jié)果(n＝10) Tab 1 Similarity evaluation (n＝10)

圖1 10批樣品HPLC色譜疊加圖Fig 1 HPLC chromatogram stacking of 10 batches of samples

2.2.5 共有峰的分析 通過對10批樣品圖譜進行分析，共標定出19個共有峰，選擇峰面積較大、保留時間居中且穩(wěn)定性好的15號峰（補骨脂素）為參照峰，分別計算10批樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2和表3，表明不同批次間制備的三方益子方相應(yīng)色譜峰的峰面積存在差異。

表2 10批供試品19個共有峰相對保留時間結(jié)果(n＝10) Tab 2 Relative retention time of 19 common peaks of 10 batches of test samples (n＝10)

表3 10批供試品19個共有峰相對峰面積結(jié)果(n＝10) Tab 3 Relative peak area of 19 common peaks of 10 batches of samples (n＝10)

2.2.6 共有峰的歸屬及指認 將供試品溶液和處方中各單味藥溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄圖譜，見圖2。與對照圖譜進行比較，其中鹽益智含有3、4、5號峰，補骨脂中含有8、9、15、16、18、19號峰，烏藥中含有2、6號峰，金櫻子中含有2、5、11號峰，覆盆子中含有2、11號峰，黃精中含有1、3、4號峰，枸杞子中含有1、3、4號峰，肉蓯蓉中含有2、3、4、7、11、12號峰，芡實中含有2號峰，桑葚中含有2、3、4、5號峰，甘草中含有3、10、11、14、17號峰。并且用對照品比對出，3號峰屬于5-羥甲基糠醛，5號峰屬于原兒茶酸，7號峰屬于松果菊苷，15號峰屬于補骨脂素，16號峰屬于異補骨脂素，17號峰屬于甘草酸。

圖2 共有峰的指認圖Fig 2 Identification of common peaks

2.2.7 特征圖譜方法學考察

① 精密度：取“2.2.2”項下供試品溶液1份，連續(xù)進樣6針，結(jié)果19個峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均分別在0.010%～0.18%和0.10%～1.9%，證明儀器精密度良好。

② 重復性：按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，進樣測定，結(jié)果19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.010%～0.50%和0.57%～2.8%，表明方法重復性良好。

③ 穩(wěn)定性：取“2.2.2”項下供試品溶液1份，于0、2、4、8、12、24 h進樣，結(jié)果19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.030%～0.44%和0.28%～2.8%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 三方益子方中4種成分含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸對照品適量，精密稱定，分別用甲醇溶解于10 mL量瓶并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.422、0.406、0.969和0.965 mg·mL－1的原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸的對照品溶液。

2.3.2 樣品及陰性樣品溶液的制備 供試品溶液制備同“2.2.2”項下方法。按處方比例分別稱取除鹽益智、金櫻子、桑葚、枸杞子外的藥材，按“2.1”和“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液①。

2.3.3 缺補骨脂陰性樣品溶液的制備 按處方比例分別稱取除補骨脂外的藥材，按“2.1”和“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液②。

2.3.4 缺炙甘草陰性樣品溶液的制備 按處方比例分別稱取除炙甘草外的藥材，按“2.1”和“2.2.2”項下的方法制備陰性樣品溶液③。

2.3.5 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果見圖3。顯示原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸4個成分的色譜峰保留時間與樣品中相應(yīng)的色譜峰保留時間一致，各個峰分離度、對稱性較好，各陰性樣品對成分測定無影響，色譜柱理論塔板數(shù)以不低于20 000為準。

圖3 三方益子方提取工藝專屬性試驗結(jié)果Fig 3 Specificity test of the extraction process of Sanfang Yizi prescription

2.3.6 標準曲線的制備 分別精密量取“2.3.1”項下各對照品溶液適量，于5 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度線，制成含原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸質(zhì)量濃度為0.041、0.0715、0.0969和0.11 mg·mL－1的 混 合 對 照品溶液，分別稀釋成系列濃度線性溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各個指標成分的峰面積，分別以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（μg，X）為橫坐標，得原兒茶酸線性回歸方 程 為Y＝2.906×103X＋4.230，R＝1.000；補骨脂素為Y＝4.844×103X＋16.58，R＝1.000；異補骨脂素為Y＝6.073×103X＋29.92，R＝1.000；甘草酸為Y＝783.9X＋2.840，R＝1.000。結(jié)果表明原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸分別在0.082～0.410 μg、0.143～0.715 μg、0.194～0.969 μg、0.22～1.10 μg內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.7 方法學考察

① 精密度考察：精密吸取“2.3.6”項下混合對照品溶液10 μL，進樣測定，連續(xù)進樣6次，結(jié)果原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸的平均峰面積RSD值分別為0.80%、0.60%、0.60%和0.61%，表明儀器精密度良好。

② 穩(wěn)定性考察：按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結(jié)果原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸的平均峰面積RSD值分別為0.64%、0.73%、0.49%和0.33%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。 ③ 重復性考察：按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，進樣測定，結(jié)果原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸的平均峰面積RSD值分別為2.3%、1.9%、1.9%和2.8%，表明方法重復性良好。

④ 加樣回收率：精密吸取“2.1”項下樣品2.5 mL，共6份，分別精密加入新配制的質(zhì)量濃度為0.95、1.049、1.057、0.53 mg·mL－1的原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸對照品溶液適量，平行制備供試品溶液6份，進樣測定。結(jié)果原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸的平均加樣回收率分別為100.58%、102.73%、98.83%和101.78%，RSD值 分 別 為1.4%、1.6%、2.0%和1.4%。

2.4 正交試驗優(yōu)化三方益子方最佳提取工藝

2.4.1 綜合評分計算公式[6-7]

其中，A為特征圖譜峰面積和，A＝A1＋A2＋……＋A19；B為原兒茶酸；C為補骨脂素；D為異補骨脂素；E為甘草酸；F為得膏率；Wi為指標權(quán)重系數(shù)。

其中，m為干膏重，M為藥材重。

其中，i為指標，αi為指標評分數(shù)，m為受檢驗?zāi)繕藢哟螖?shù)。

其中，CR為一致性比例因子；RI為一致性指標，具體參照表4。

表4 平均隨機一致性指標RI值 Tab 4 Average random consistency index RI value

2.4.2 指標權(quán)重的確定[9]根據(jù)三方益子復方中藥味的君臣佐使配伍規(guī)律、各成分藥理作用強弱以及有效成分所歸屬的藥味多少，本研究將特征圖譜峰面積總和，原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸峰面積和得膏率作為權(quán)重指標予以量化，即將6項指標分成5個層次，各層次評分標準見表5，并確定優(yōu)先順序：特征圖譜峰面積總和＞原兒茶酸＞補骨脂素＝異補骨脂素＞甘草酸＞得膏率，構(gòu)建優(yōu)先判斷矩陣，見表6。

表5 各層次評分標準 Tab 5 Grading criteria for each level

表6 指標成對比較判斷優(yōu)先矩陣 Tab 6 Pairwise comparison judgment priority matrix of indicators

按照“2.4.1”項下綜合評分計算公式得出特征圖譜峰面積總和，原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸和得膏率的權(quán)重系數(shù)分別為0.3939、0.2372、0.1346、0.1346、0.0655、0.0343，一致性比例因子（CR）＝0.016 47＜0.10，指標優(yōu)先比較判斷矩陣具有滿意的一致性，求得的權(quán)重系數(shù)有效。

2.4.3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇影響因素為提取時間（A，2 h、2.5 h、3 h）、料液比（B，1∶12、1∶14、1∶16）、提取次數(shù)（C，1、2、3次），L9（34）為正交表進行正交試驗，以特征圖譜峰面積總和，原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸的峰面積，以及得膏率的綜合評分為評價指標，根據(jù)“2.4.1”項下方法計算綜合總評分，并進行直觀分析與方差分析。因素與水平見表7，正交試驗設(shè)計直觀分析結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表7 因素與水平表 Tab 7 Factor and level

表8 三方益子方提取正交試驗直觀分析結(jié)果(n＝2) Tab 8 Visual analysis of orthogonal experiment of Sanfang Yizi prescription (n＝2)

表9 三方益子方正交試驗的方差分析結(jié)果 Tab 9 ANOVA of Sanfang Yizi prescription of orthogonal test

直觀分析結(jié)果示3個因素的主次關(guān)系為B＞C＞A，方差分析結(jié)果表明B、C因素對綜合評分結(jié)果均具有顯著影響，A不顯著，正交試驗結(jié)果表明最佳工藝為A3B2C3，即加14倍水，提取3次，每次3 h，但結(jié)合生產(chǎn)成本、經(jīng)濟效益等因素，即最佳提取工藝為加14倍水，提取3次，每次2 h。

2.4.4 正交試驗驗證結(jié)果 按照最佳提取工藝提取3批藥，根據(jù)建立的含量測定方法和特征圖譜方法，進行測定，計算綜合評分，結(jié)果表明工藝穩(wěn)定，重復性好，可作為該方的水提工藝（見表10）。

表10 驗證試驗結(jié)果 Tab 10 Verification test

3 總結(jié)與討論

質(zhì)量標志物基于有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五要素”為核心，既反映了與有效性（和安全性）的關(guān)聯(lián)關(guān)系，又體現(xiàn)中藥成分的專屬性、差異性特征，特別是基于方-證對應(yīng)的配伍環(huán)境，使質(zhì)量研究回歸到中醫(yī)藥理論，體現(xiàn)針對疾病的中藥有效性表達方式及其物質(zhì)基礎(chǔ)的客觀實質(zhì)[10]。中藥特征圖譜現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于整體反映中藥成分復雜性的研究中，可對某些特征成分進行指認及分析，是中藥的有效質(zhì)量控制與評價方法[11]。三方益子復方成分繁多復雜，采用單一指標考察工藝，一味追求個別成分含量最大，使得結(jié)果太過片面，應(yīng)全面綜合權(quán)衡，與現(xiàn)代技術(shù)特征圖譜等結(jié)合，盡可能覆蓋君臣佐使藥材中的有效成分來反映中藥復方的有效成分群體，嘗試用未知的結(jié)構(gòu)成分的模糊數(shù)據(jù)（特征色譜峰的總面積之和）相結(jié)合的方法，進行多指標的綜合評定[12]。

三方益子方中質(zhì)量標志物基于“君”藥首選原則，兼顧“臣”“佐”“使”藥的有效成分來篩選，君藥鹽益智中原兒茶酸可通過抗氧化應(yīng)激作用抗氧化應(yīng)激保肝[13]，尚可改善老年大鼠的認知能力，具神經(jīng)保護功能[14]，且本方中臣藥金櫻子，佐藥桑葚、枸杞子中亦含原兒茶酸成分。君藥補骨脂中補骨脂素可改善腎虛的癥狀，提升老年人的記憶力和認知能力[15]，保護神經(jīng)細胞，預(yù)防阿爾茨海默病的發(fā)生[16]，補骨脂素、異補骨脂素均可抑制小鼠前列腺增生，改善夜尿增多的癥狀[17]，也是治療老年人易患疾病骨質(zhì)疏松癥的活性成分[18]。佐藥炙甘草中甘草酸成分被用作炙甘草配方顆粒的評價指標，具有很好的改善肝臟功能的作用[19]，對各種慢性腎臟疾病具有一定的療效，保護藥物性腎臟損傷[20]，也能夠促進腦功能恢復，提升老年人的記憶力和認知能力，降低阿爾茨海默病的發(fā)生[21]，尚可提高機體免疫力[22]。 多指標綜合評價的方式已成為復方制劑優(yōu)選提取工藝的重要手段，AHP是一種將評價指標定性與定量相結(jié)合的決策分析方法，不僅考慮了主觀意識對各項指標的重視程度，又考慮了各項指標原始數(shù)據(jù)之間的相互聯(lián)系及影響，增強了總體評價結(jié)果的科學性及合理性[6]。本研究采用HPLC建立三方益子水提液特征圖譜，標定涵蓋了11味藥材的19個共有峰，建立了原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸含量測定方法，選用共有峰總面積，原兒茶酸、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸和得膏率作為指標進行考察，避免了以單一指標的局限性，與中藥復方的多組成、多靶點作用特點相吻合[9]。