胡金霞，楊 帆，盧 軍，王洪霞，江 鈺，劉 濤，胡曉靈△

1新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，新疆 烏魯木齊830000；2新疆軍區(qū)總醫(yī)院健康管理科

失眠為臨床常見病，多發(fā)病。隨著社會發(fā)展，本病發(fā)病率逐年升高。有報道2006年中國內(nèi)地成年人中有失眠癥狀者達57%［1］。失眠嚴重危害人類身體健康，是高血壓、心肌梗死、慢性心力衰竭、2型糖尿病的重要危險因素之一［2-6］，并且和癡呆呈正相關(guān)［7］。導致失眠的病因復雜，與心理、社會和環(huán)境因素密切相關(guān)，病機涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫等方面。失眠是與神經(jīng)免疫系統(tǒng)失衡的相關(guān)疾病。參與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的細胞因子主要有白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）［8］。IL-1β具有多種生物學功能，通過調(diào)節(jié)控制睡眠作用來參與睡眠-覺醒過程。TNF-α在免疫系統(tǒng)影響睡眠過程中起中介作用?；诖耍狙芯坎捎镁耙掳采裆⒀ㄎ环筚N于對苯丙氨酸（PCPA）致失眠模型大鼠的神闕、內(nèi)關(guān)穴，通過觀察失眠大鼠行為學以及炎性細胞因子，探討其治療失眠的機理。

1 材料與方法

1.1 動物分組根據(jù)我國科技部發(fā)財字（2006）398號《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》中有關(guān)內(nèi)容處置動物。雄性大鼠64只，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供，動物許可證號：SCXK新2003-0002，體質(zhì)量（200±20）g。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，光照充分，定時通風換氣，飼養(yǎng)期間大鼠自由攝水及飲食。飼養(yǎng)7天后隨機分為對照組、模型組、空白組、實驗組各16只。其中模型組、空白組及實驗組腹腔注射PCPA制造睡眠剝奪模型［9］。

1.2 PCPA致失眠大鼠模型的構(gòu)建

1.2.1 失眠模型的建立將PCPA（艾覽化工科技有限公司，貨號A46786）用弱堿性生理鹽水配置成混懸液，按45 mg/100 g體質(zhì)量腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射2天造模。

1.2.2 造模成功的評判標準與對照組比較，造模后大鼠行為發(fā)生改變，如晝夜節(jié)律顛倒，白天活動明顯增多，睡眠時間減少，性情煩躁，攻擊性增強，表明造模成功［10］。

1.3 方法

1.3.1 對照組與模型組對照組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液（國藥集團新疆制藥有限公司，國藥準字20023486，100 mL∶0.9，規(guī)格：1 mL/100 g）每日1次，連續(xù)注射2天，飼養(yǎng)7天。模型組僅造模不進行任何干預(yù)，飼養(yǎng)7天。

1.3.2空白組敷貼方法參考文獻［11-13］：固定大鼠后將神闕、內(nèi)關(guān)穴穴位附近的毛剪短，脫凈，大約1 cm×2 cm大小，75%酒精消毒，將空白敷膜敷貼于穴位上，每天1次，每次30 min，連續(xù)7天。

1.3.3 實驗組造模后將景衣安神散敷貼于神闕、內(nèi)關(guān)穴，貼敷方法同空白組。

1.4 觀察指標

1.4.1 行為學于第7天觀察各組大鼠行為。

1.4.1.1 曠場實驗將大鼠放入40 cm×40 cm敞箱（箱壁和底為黑色，箱底用黃色膠帶劃分為面積相等的16個矩形）的中央，大鼠在木箱中適應(yīng)1 min，在安靜環(huán)境中記錄3 min內(nèi)橫跨格子數(shù)（四爪均進入方格可記數(shù)）及站立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附箱壁可記數(shù)，洗臉不算）、中央格停留時間、修飾次數(shù)以及糞便數(shù)。實驗結(jié)束后取出大鼠［14］。

1.4.1.2 懸尾實驗大鼠被懸掛于距離桌面50 cm高的水平環(huán)狀架桿上，用膠帶固定鼠爪尖2 cm，記錄1 min內(nèi)大鼠倒掛時向上翻轉(zhuǎn)掙扎的總次數(shù)，并用秒表記錄大鼠靜止不動狀態(tài)的總時間（絕望時間）［10］。

1.4.2 細胞因子測定實驗第8天用100 g/L水合氯醛大鼠腹腔注射（2～3 mL/kg）麻醉大鼠后，腹腔靜脈取血3 mL，靜置1 h后，4℃過夜，離心半徑13.5 cm，1500 r/min，離心30 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sor‐bent assay,ELISA法）檢測IL-1β［ELISA試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP12225）]以及TNF-α［ELISA試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP12250）]。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 失眠大鼠行為學

2.1.1 大鼠空曠實驗評分與對照組比較，模型組大鼠空曠實驗得分增加、中央格停留時間縮短，修飾次數(shù)和糞便顆粒增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組大鼠空曠實驗得分降低，中央格停留時間縮短，修飾次數(shù)與糞便顆粒數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與空白組比較，實驗組大鼠空曠實驗得分減少，中央格停留時間縮短，糞便顆粒數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），修飾次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠空曠實驗結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠空曠實驗結(jié)果（±s）

注：△表示與對照組比較，P＜0.01；*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與空白組比較，P＜0.01

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2.1.2 懸尾實驗與對照組比較，模型組大鼠掙扎次數(shù)增加、絕望時間延長差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，實驗組大鼠掙扎次數(shù)與絕望時間縮短差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與空白組比較，實驗組大鼠掙扎次數(shù)增加，絕望時間延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠掙扎次數(shù)與絕望時間比較（±s）

表2 各組大鼠掙扎次數(shù)與絕望時間比較（±s）

注：△表示與對照組比較，P＜0.01；*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與空白組比較，P＜0.01

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2.2 血清lL-1β與TNF-α含量與對照組比較，模型組大鼠IL-1β與TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，實驗組大鼠IL-1β與TNF-α含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），空白組大鼠IL-1β含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與空白組比較，實驗組IL-1β含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），TNF-α含量增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清lL-1β與TNF-α含量（±s）ng/mL

表3 各組大鼠血清lL-1β與TNF-α含量（±s）ng/mL

注：△表示與對照組比較，P＜0.01；*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與空白組比較，P＜0.01

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3 討論

失眠，又稱睡眠障礙，睡眠質(zhì)量下降，不能正常入睡，睡眠時間變短，睡眠輕淺，容易覺醒，甚至徹夜不眠，使患者身心健康受到嚴重影響［15］。近年來，發(fā)病率逐漸升高，據(jù)報道，我國成年人中失眠發(fā)生率達38.2%［16］。失眠常伴有焦慮、抑郁等不穩(wěn)心態(tài)，不但影響患者的日常生活，同時可以誘發(fā)或加重軀體其他疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，失眠的發(fā)生有社會-心理-環(huán)境的諸多因素，主要與下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸調(diào)節(jié)失衡有關(guān)，神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)是機體調(diào)整內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。當細菌、病毒侵犯機體后激活免疫系統(tǒng)，通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響HPA軸，參與睡眠調(diào)節(jié)。IL-1β與TNF-α均為參與HPA軸調(diào)節(jié)睡眠的細胞因子［10］，通常作用于下丘腦視上核神經(jīng)元，刺激神經(jīng)內(nèi)分泌激素分泌，從而調(diào)節(jié)睡眠。在生理狀態(tài)下IL-1β可以調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌功能以及免疫系統(tǒng)，參與免疫應(yīng)答，促進睡眠。研究證實IL-1β在睡眠開始時達到峰值[17]，明顯促進慢波睡眠，參與睡眠調(diào)節(jié)。人剝脫睡眠后，腦脊液與體液中IL-6的含量增加，外周IL-1含量減少［18］。SINT等［19］發(fā)現(xiàn)失眠時IL-1含量降低,睡眠好轉(zhuǎn)時IL-1β升高。TNF-α一般由外周巨噬細胞、淋巴細胞和中樞星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，是一種具有多種生物學效應(yīng)的細胞因子，在外周免疫反應(yīng)、炎癥過程中起重要作用。TNF-α不但是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)睡眠的中介，能促進神經(jīng)遞質(zhì)更新，調(diào)節(jié)睡眠；而且還能調(diào)節(jié)睡眠質(zhì)量，顯著增加慢波睡眠所占比例[10]。研究［20］發(fā)現(xiàn)TNF-α能促進大鼠、小鼠腦內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）合成，通過提高5-HT及其代謝產(chǎn)物5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)含量增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT功能，從而調(diào)節(jié)睡眠。也有研究證實，外源性IL-1β、TNF-α均可誘發(fā)動物睡眠[21]。病毒、細菌及應(yīng)激等刺激可以誘發(fā)TNF-α釋放，TNF-α可以互相刺激互相誘導共同參與睡眠的調(diào)節(jié)。研究證實，良好的睡眠及健康的心態(tài)均激活免疫系統(tǒng)，促進單核細胞分泌IL-1β與TNF-α，從而改善睡眠節(jié)律[22]。

中醫(yī)認為本病主要在心，病機主要是陽盛陰衰，陰陽失交。胡曉靈主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，以新疆地產(chǎn)中草藥薰衣草、紅景天為基礎(chǔ)，配合郁金、石菖蒲研制的景衣安神散，選擇神闕以及雙側(cè)內(nèi)關(guān)、涌泉進行穴位貼敷治療失眠。紅景天與薰衣草具有耐嚴寒、抗干旱、易成活的特性，在新疆大量人工栽培。紅景天，性寒，味甘澀，歸肺、心經(jīng)，具有扶正固本、調(diào)和陰陽、補氣清肺，益智養(yǎng)心的功效，現(xiàn)代藥理研究證實，可抗疲勞、耐缺氧、增強免疫、維持神經(jīng)系統(tǒng)興奮和抑制的平衡、抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠［23］。薰衣草為維吾爾醫(yī)常用藥材，首載于阿維森納著《醫(yī)典》，偏溫，具有清腦安神，散寒止痛功效［24］?，F(xiàn)代藥理研究證實［25］薰衣草具有抗菌、鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、解痙、鎮(zhèn)痛及抑制變態(tài)反應(yīng)等功效；郁金，味辛，性苦寒，入心、肝、膽、肺經(jīng)，辛散苦降，具有行氣解郁，清心涼血、開竅化痰的功效；石菖蒲，辛苦溫，除濕化痰，醒腦開竅，二藥與薰衣草相須為用，能芳香化濕，豁痰開竅，解郁祛瘀，清腦定志。諸藥為散劑，通過貼敷內(nèi)關(guān)、神闕及涌泉穴位刺激經(jīng)絡(luò)，共奏補氣活血，理氣解郁，養(yǎng)心安神功效。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該藥可以延長失眠患者睡眠時間，改善失眠伴隨癥狀，改善日間功能障礙，提高睡眠質(zhì)量和效率［26-28］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模后大鼠正常的睡眠-覺醒周期紊亂，模型組大鼠空曠實驗得分、中央格停留時間縮短，糞便顆粒增加（P＜0.01），修飾次數(shù)增加（P＜0.01）；大鼠掙扎次數(shù)增多，絕望時間延長（P＜0.01），表明模型組大鼠比較緊張、躁動、絕望，在一定程度上反映成功復制失眠模型。與模型組比較，實驗組大鼠空曠實驗得分、中央格停留時間以及糞便顆粒均減少（P＜0.01），修飾次數(shù)與掙扎次數(shù)減少，絕望時間縮短（P＜0.01），說明中藥穴位貼敷可以緩解大鼠的緊張程度，趨向安靜狀態(tài)，具有鎮(zhèn)靜催眠作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β與TNF-α含量均下降（P＜0.01）。治療后與模型組比較，實驗組失眠大鼠血清IL-1β以及TNF-α逐漸升高（P＜0.01）。證實中藥穴位貼敷可以使失眠大鼠血清IL-1β與TNF-α含量升高，誘導失眠大鼠睡眠，恢復正常的睡眠-覺醒周期，這可能與景衣安神散理氣解郁安神功效有關(guān)。