王文思，員瑜，王佳敏，施佳林，蹇林格，趙瀅，張?zhí)毂?/p>

（1.中國醫(yī)科大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室，沈陽 110122；2.中國科學院沈陽自動化研究所機器人研究室，沈陽 110016；3.四川大學華西臨床醫(yī)學院，成都 610041；4.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院胃腸營養(yǎng)外科，沈陽 110004）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉源性惡性腫瘤［1］。1983年，美國病理學家MAZUR和CLARK首先提出了GIST的概念［2］。GIST每年發(fā)病率約為10/100萬～20/100萬［3］，常發(fā)生在50歲以上人群。在約80%的GIST中發(fā)現(xiàn)致癌的c-kit突變，其11號外顯子突變是GIST中最常見的致癌突變（67%）［4］，這些突變包括點突變、框內(nèi)缺失或插入，其余的突變?yōu)?號外顯子編碼突變（10%），13和17號外顯子中有較小程度的激活突變（＜2%）。約15%的GIST由血小板源性生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）多肽激活驅動，12、14和18號外顯子顯示致癌突變。野生型GIST占GIST的5%～10%，不含c-kit或PDGFRα突變。由于受體酪氨酸激酶信號依賴，GIST可以用酪氨酸激酶抑制劑有效治療，如伊馬替尼、舒尼替尼和索拉非尼。盡管大多數(shù)患者的初始反應良好，但隨著時間的推移，異質(zhì)性耐藥機制的發(fā)展，大多數(shù)患者的病情都有所進展。目前進行的研究旨在評估具有其他作用機制的藥物，單獨或與伊馬替尼或其他酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合使用，以避免高耐藥率。有研究［5］顯示，靶向蛋白激酶B抑制劑MK-2206似乎不足以抑制GIST細胞的生長和存活，然而將MK-2206與伊馬替尼聯(lián)合使用可顯著提高療效。目前的數(shù)據(jù)表明，在GIST中靶向多個分子靶點比單一治療更有效，未來可嘗試在臨床中實踐應用。

原子力顯微鏡利用探針接觸分子水平和細胞水平的樣品，可對生物體在近生理環(huán)境下進行納米級成像及力學特性研究［6］。原子力顯微鏡由微懸臂、檢測系統(tǒng)、施加力和距離的反饋控制系統(tǒng)、壓電陶瓷控制的移動系統(tǒng)、獲取數(shù)據(jù)與分析系統(tǒng)組成。許多疾病的起源可以從細胞的力學性質(zhì)來考慮，如細胞黏彈性的改變和楊氏模量的改變與癌癥轉移和惡性轉化有關。原子力顯微鏡的力學測量提供了一種潛在的、基于單細胞尺度進行疾病診斷的新方法，探究其檢測過程中力學性質(zhì)的轉變與人類疾病進展的關聯(lián)性，進而挖掘出力學檢測方法在藥效評估中的潛在價值［7］。

從患者體內(nèi)分離的原代細胞比已經(jīng)建立的來源相似的細胞系更適合于實驗研究，可能更準確地模擬患者情況，為體外藥物敏感性試驗和設計個體化治療方案提供更好的工具。本研究成功建立原代GIST細胞，將伊馬替尼與舒尼替尼聯(lián)合用藥作為GIST新的治療方案，分析二者聯(lián)合有無協(xié)同增效作用，并利用原子力顯微鏡對原代培養(yǎng)的GIST細胞進行藥物作用后機械特性測量，初步探討二者聯(lián)合作用的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

甲磺酸伊馬替尼片購自瑞士Novartis Pharma Schweiz AG公司，蘋果酸舒尼替尼膠囊購自意大利Pfizer公司，胎牛血清購自中國Gibco公司，RPMI-1640、胰酶、雙抗購自以色列BI公司，CCK-8試劑盒購自美國Invigentech公司，膠原酶購自美國Sigma公司，PCR引物的合成和序列測定由上海生工生物公司完成，QIAamp RNA Mini Kit、QIAGEN OneStep RTPCR Kit購自德國QIAGEN公司。伊馬替尼和舒尼替尼分別配制成2 000 μmol/L的母液，-80 ℃保存，使用時倍比稀釋至3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00 μmol/L濃度的工作液。

1.2 原代細胞培養(yǎng)

仔細剔除GIST組織外周可能污染和壞死的組織，標本用D-Hanks液洗2次，再用含雙抗的無血清RPMI-1640沖洗5～6次。在培養(yǎng)皿中用無菌眼科剪將GIST組織中心剪成數(shù)個小組織塊（盡量避開血管），盡量剪碎。將剪碎的組織塊移到離心管中再次洗滌3次。加入2倍體積的1 mg/mL胰酶和1 mg/mL膠原酶，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化60 min。收集單個和小塊組織的瘤細胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌3次，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為含15%胎牛血清的RPMI-1640，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。第2天輕輕吸棄上清液，換新鮮培養(yǎng)液，此后每隔5 d換液或傳代1次。

1.3 PCR實驗

采用QIAGEN RNeasy Mini Kit進行GIST細胞總RNA進行提取。基因引物序列：c-kit8號外顯子，上游引物5’-CAGCAGTCTGACCTATGGC-3’，下游引物5’-GCTCAGCTCCTGGACAGAAA-3’；c-kit9號 外顯子，上游引物5’-GATTGATTGATTGATTTTCCTAG-3’，下游引物5’-GCAGGCAGAGCCTAAACATC-3’；c-kit11號外顯子，上游引物5’-CCAGAGTGCTCTAAT GACTGAGA-3’，下游引物5’-AAACAAAGGAAGCC ACTGGA-3’；c-kit13號外顯子，上游引物5’-TACTG CATGCGCTTGACATC-3’，下游引物5’-TAATCTAG CATTGCCAAAATCA-3’；c-kit17號外顯子，上游引物5’-CATCATTCAAGGCGTACTTTTG-3’，下游引物5’-TGCAGGACTGTCAAGCAGAG-3’；PDGFRα12號外顯子，上游引物5’-TCCAGTCACTGTGCTGCTTC-3’，下游引物5’-AAGACTCCCTTTTCCCTTGC-3’；PDGFRα14號外顯子，上游引物5’-ACTGGTTTTGGTTCCCAC AG-3’，下游引物5’-CAATGATTCGCAGCAACG-3’；PDGFRα18號外顯子，上游引物5’-ACCATGGATCA GCCAGTCTT-3’，下游引物5’-GGTCAGGCTCATCC TCCTTCA-3’。按照QIAGEN OneStep RT-PCR Kit說明書進行PCR擴增體系配制及PCR擴增。

1.4 CCK-8法測定GIST細胞體外藥物敏感性

將生長處于對數(shù)期的貼壁GIST細胞消化后轉移至離心管，1 000 r/min低速離心離心5 min，進行細胞計數(shù)。實驗分為空白對照組、伊馬替尼組、舒尼替尼組和聯(lián)合用藥組，每組設置5個復孔，每孔加入稀釋好的細胞懸液。接種48 h，細胞貼壁生長良好后吸出各孔培養(yǎng)基。分別加入31.25 μmol/L伊馬替尼、15.63 μmol/L舒尼替尼以及31.25 μmol/L伊馬替尼和15.63 μmol/L舒尼替尼聯(lián)合處理的細胞生長液，放入孵箱分別培養(yǎng)24、48和72 h。藥物處理相應時間后，加入10% CCK-8溶液，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，待培養(yǎng)基液體變?yōu)槌壬纯煞湃朊笜藘x檢測。酶標儀波長設定為450 nm，測定吸光度值，分析數(shù)據(jù)。

1.5 原子力顯微鏡檢測GIST細胞楊氏模量

應用Icon 原子力顯微鏡（美國Veeco）和MLCT探針（彈性系數(shù)為0.01 N/m），以2 μm/s的速率在近生理條件下，測定藥物作用前后原代培養(yǎng)的GIST細胞的楊氏模量，即細胞機械彈性。逼近曲線記錄了探針在逼近接觸細胞并在細胞表面產(chǎn)生壓痕的過程，回退曲線記錄了探針從細胞表面回退到原始位置的過程。分析逼近曲線，計算不同藥物處理后GIST細胞的楊氏模量值。每個實驗組測量5個GIST細胞，每個細胞壓10條以上力曲線。

根據(jù)計算公式（1）和（2）可知需要測量得到懸臂梁的偏轉量x和壓痕深度δ，其余的參量為已知的或是通過實驗測量得到的［8］。應用Nanoscope ⅣAFM系統(tǒng)和商用Nanoscope軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 GIST細胞原代培養(yǎng)

取瘤組織消化后進行培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的GIST細胞呈梭型、多角形、核大，互不重疊，呈單層生長。見圖1。

圖1 GIST細胞倒置顯微鏡下圖像Fig.1 Inverted microscopic image of gastrointestinal stromal tumor cells

2.2 外顯子測序分析

對原代培養(yǎng)的GIST細胞進行總RNA的提取，并對c-kit和PDGFRα基因的8個外顯子進行核酸擴增和正向、反向測序比對，見圖2。得到的序列與NCBI中Blast庫的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)c-kit基因11號外顯子發(fā)生點突變，胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰剩瑸殡s合性突變。此點突變致使GIST細胞11號外顯子的第559位氨基酸由由纈氨酸（GTT）突變?yōu)樘於彼幔℅AT），導致了GIST的發(fā)生，見圖3。其余外顯子無突變。本研究中，原代培養(yǎng)的GIST細胞已經(jīng)傳30余代，在傳至30代時進行以上測序，未發(fā)現(xiàn)二次突變。

圖2 c-kit基因11號外顯子發(fā)生點突變Fig.2 Point mutation in exon 11 of the c-kit gene

圖3 第559位點纈氨酸突變?yōu)樘於彼酕ig.3 Mutation of valine to aspartic acid at site 559

2.3 藥物敏感性結果

CCK-8實驗結果顯示，伊馬替尼單獨作用于GIST細胞24 h時，7.81 μmol/L濃度組與對照組比較，細胞抑制率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖4A）。舒尼替尼單獨作用于GIST細胞24 h時，15.63 μmol/L濃度組與對照組比較，細胞抑制率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖4B）。2種藥物對GIST細胞的作用均呈時間與濃度依賴性。聯(lián)合用藥組為等濃度聯(lián)合作用，抑制效果更顯著（圖4C）。

圖4 伊馬替尼和舒尼替尼單獨和聯(lián)合作用于GIST細胞時細胞增殖率的變化Fig.4 Changes in proliferation rate of GIST cells treated with imatinib and sunitinib alone or in combination

藥物作用48 h時，伊馬替尼組的IC50值為34.23±0.37，舒尼替尼組為28.85±0.52，同濃度聯(lián)合用藥組為11.97±0.18。CompuSyn是一款根據(jù)Chou-Talalay數(shù)學模型建立的應用軟件，通過計算聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）分析兩藥聯(lián)合作用效果：CI＜1時，兩藥為協(xié)同作用效果；CI=1時，兩藥為疊加作用效果；CI＞1時，兩藥為拮抗作用效果。本研究結果顯示，當生長抑制率Fa＜1時，大部分CI＜1，且Fa值越小CI值越小。當Fa值介于0.1～0.7之間時，CI值介于0.90～0.98之間，說明兩藥聯(lián)合作用效果較好。因此，本研究后續(xù)實驗單獨用藥組選擇31.25 μmol/L伊馬替尼和15.63 μmol/L舒尼替尼（此時兩藥抑制率均在80%左右），聯(lián)合用藥組選用同濃度藥物處理細胞，此濃度下聯(lián)合作用為協(xié)同作用。

2.4 楊氏模量測量結果

采用Icon 原子力顯微鏡和MLCT探針對GIST細胞測量楊氏模量（圖5），藥物作用48 h后，空白對照組楊氏模量為（8.26±1.06）kPa，伊馬替尼組為（4.90±0.54）kPa，舒尼替尼組為（5.51±0.79）kPa，聯(lián)合用藥組為（2.66±1.08）kPa。高斯擬合結果（圖6）顯示，伊馬替尼和舒尼替尼均可引起細胞楊氏模量減小，聯(lián)合用藥效果更顯著（P＜ 0.01）。

圖5 MLCT針尖圖像和探針測量細胞楊氏模量Fig.5 Image of MLCT tip and measurement of Young's modulus by probe

圖6 GIST細胞楊氏模量高斯擬合函數(shù)分布Fig.6 Gaussian fitting function distribution of Young’s modulus of gastrointestinal stromal tumor cells

3 討論

GIST的發(fā)生、發(fā)展由多種腫瘤相關分子突變所致，目前認為c-kit或PDGFRα受體酪氨酸激酶的組成型激活突變是致癌的起始事件。突變的受體蛋白在不依賴配體的情況下持續(xù)自我激活，引起下游信號通路蛋白增多，導致細胞增殖和分化、腫瘤形成。

伊馬替尼作為酪氨酸激酶抑制劑，最初被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療慢性粒細胞白血病，之后被批準作為轉移性和復發(fā)性GIST的一線藥物。然而，大多數(shù)患者會在2年內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［9］。研究［10］顯示，在具有GIST 11號外顯子密碼子557～558突變的患者中，伊馬替尼治療后患者也存在生存時間減少的趨勢。因此，迫切需要能夠與伊馬替尼聯(lián)合應用的凋亡誘導劑。而舒尼替尼既可抑制血管內(nèi)皮生長因子受體和轉染過程中的重排，又可以阻斷腫瘤生長所需的血液和營養(yǎng)物質(zhì)供給，有可能解決GIST患者的伊馬替尼耐藥性問題。

本研究成功培養(yǎng)c-kit基因11號外顯子發(fā)生點突變的GIST細胞，V559D為GIST細胞突變的熱點。為研究舒尼替尼對伊馬替尼處理GIST細胞的增效作用，本研究采用CCK-8實驗檢測兩藥單獨和聯(lián)合用藥對GIST細胞的增殖抑制作用。結果顯示，2種藥物對原代培養(yǎng)的V559D突變的GIST細胞均有明顯的生長抑制作用，呈時間與劑量依賴性，且聯(lián)合用藥的抑制效果大于單獨用藥（P＜ 0.05）。

從生物學角度分析，細胞對外界刺激的機械反應和細胞內(nèi)部的生物力學反應，對保持細胞的生物活性具有重要意義。細胞通過改變自身行為和重塑微環(huán)境，動態(tài)適應機械因素的刺激，這種動態(tài)適應的結果不僅對胚胎發(fā)育和成人生理具有決定性作用，還與許多疾病密切相關。如在癌癥形成過程中，為了促進與腫瘤轉移相關的微血管生成和建立，癌細胞楊氏模量和黏附力逐漸降低。同樣，侵襲性細胞通常楊氏模量和黏附性更低，但在不同器官和來源于不同器官的癌細胞中可能有不同的結論。這種機械特性的變化可能是由肌動蛋白絲引起的，肌動蛋白骨架的溶解導致楊氏模量顯著降低［11］。因此，機械特性近來被認為是一種新的生物標志物，而細胞表面機械特性研究另外一個最大的優(yōu)勢，在于能夠在保證細胞存活的擬生理條件下，對活細胞進行檢測，進而得到大量有效仿真的生物學數(shù)據(jù)。

有研究［12］指出，伊馬替尼通過降低鞘氨醇-1-磷酸進而引起肺癌細胞骨架蛋白重新分布，并同時降低了細胞的楊氏模量。LEE等［12］發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α刺激內(nèi)皮細胞后，機械剛度增加了50%。KUNG等［13］則指出，順鉑處理的黑色素瘤細胞可以增強細胞骨架的機械拉伸，還可促進細胞骨架的重排，導致細胞楊氏模量降低43%。CAI等［14］采用不同濃度的青蒿琥酯作用細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)細胞的楊氏模量下降了近三分之一。WANG等［15］指出，與對照樣品相比，經(jīng)佛波酯處理的K562細胞的彈性模量增加了近3倍。因此，本研究采用納米壓痕技術，在擬生理狀態(tài)下，對GIST細胞表面機械特性的變化進行檢測，從而探討藥物產(chǎn)生的作用。通過檢測伊馬替尼、舒尼替尼及二者聯(lián)合用藥處理前后GIST細胞機械強度的變化，通過軟件測量分析發(fā)現(xiàn)藥物處理后GIST細胞楊氏模量降低，聯(lián)合用藥效果更明顯。原子力顯微鏡的納米力學檢測技術可實現(xiàn)在近生理條件下測定癌細胞機械強度變化，為藥物研發(fā)早期評估抗癌藥物作用效率方面提供依據(jù)。

綜上所述，伊馬替尼和舒尼替尼對GIST細胞有增殖抑制作用，呈作用時間與劑量依賴性，聯(lián)合用藥時表現(xiàn)為協(xié)同作用。本研究基于納米壓痕技術發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼和舒尼替尼均降低了GIST細胞的楊氏模量，聯(lián)合用藥時機械性能改變更明顯。