郭庭維，楊召銘，李峰，林建貞，張城碩，孫寧，李曉航，張佳林

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，沈陽 110001）

自Edmonton方案問世以來，胰島移植在過去的幾十年間取得了顯著進(jìn)展，目前被認(rèn)為是治療1型糖尿病最有前景的方法之一［1］。胰島移植可以恢復(fù)糖尿病患者胰島素的生理性分泌，最大限度降低因嚴(yán)重低血糖導(dǎo)致的死亡風(fēng)險。目前臨床胰島移植尚存在許多不足，主要包括供胰短缺、需要終身使用免疫抑制藥物及胰島移植物體內(nèi)長期存活率低等。其中，缺氧是導(dǎo)致移植前培養(yǎng)胰島及移植后胰島移植物活性及功能喪失的關(guān)鍵因素之一［2-6］。因此，避免胰島受到缺氧損傷具有重要的臨床意義。

人羊膜提取物（human amniotic membrane extract，hAME）是一種天然的生物材料，含有豐富的生物活性分子，目前已被臨床應(yīng)用于眼部疾病的治療。研究［7-10］表明，hAME能促進(jìn)組織再生和傷口愈合，具有減輕炎癥反應(yīng)和減少氧化應(yīng)激損傷的功能。

本研究通過建立小鼠腎被膜下胰島移植模型，擬探討hAME對小鼠胰島缺氧損傷的保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制，進(jìn)一步通過體內(nèi)移植研究驗(yàn)證在缺氧狀態(tài)下經(jīng)hAME預(yù)處理的胰島治療糖尿病的效果。

1 材料與方法

1.1 動物

C57BL/6小鼠由遼寧長生生物科技有限公司提供。選擇6～8周齡、體質(zhì)量18～22 g的雄性C57BL/6小鼠作為胰島供體和糖尿病受體。所有手術(shù)均采用異氟醚吸入麻醉（RWD，中國瑞沃德公司）。本研究按照國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物指導(dǎo)與使用指南進(jìn)行，并經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 hAME的制備

本研究通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)（［2019］2019-219-3），選取在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)的健康產(chǎn)婦，經(jīng)受試者同意且簽署知情同意書后，收集剖宮產(chǎn)孕婦羊膜。將人羊膜用含1 000 U/mL青霉素和 0.1 mg/mL鏈霉素雙抗的PBS清洗3次，洗去殘余的血塊。羊膜切成碎塊后置于液氮中研磨成細(xì)粉。稱重后按質(zhì)量體積比1 ∶1加入PBS混合，在冰上用超聲勻漿機(jī)以10 000 r/min的參數(shù)超聲勻漿1 h。然后在4 ℃離心機(jī)中以4 000g的離心力離心10 min，收集上清，以15 000g的離心力離心5 min。收集最終上清液并通過0.22 μm濾器濾菌，即得hAME，所得hAME置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小鼠胰島的分離和缺氧培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死小鼠，充分暴露腹腔，用6-0絲線結(jié)扎膽總管匯入十二指腸處后，用膠原酶V（1 mg/mL）2～3 mL充分灌注小鼠胰腺，在37 ℃恒溫水浴鍋中靜置消化20 min。然后，用含10% FBS的預(yù)冷Hanks平衡鹽溶液終止消化。使用Ficoll密度梯度離心法純化小鼠胰島（密度1.108、1.096、1.069和1.037 g/mL），并通過體視顯微鏡手動挑選，進(jìn)一步純化小鼠胰島。將純化后的小鼠胰島隨機(jī)分為4組：1%O2缺氧培養(yǎng)組、缺氧培養(yǎng)加hAME實(shí)驗(yàn)組、正常氧氣培養(yǎng)組、正常氧氣培養(yǎng)加hAME組。各組胰島置于37 ℃濕潤的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。胰島基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含10%FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640。

1.4 胰島活性檢測

缺氧培養(yǎng)12 h后，用吖啶橙（acridine orange，AO，美國Sigma公司）和溴化乙錠（ethidium bromide，EB，美國Sigma公司）染色評估胰島的活性，其中活細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈綠色。采集熒光圖像并使用Image J軟件分析胰島細(xì)胞的活性。小鼠胰島的活性通過以下公式計算：胰島活性（%）=綠色熒光所占面積/（綠色熒光所占面積+紅色熒光所占面積）×100。

1.5 葡萄糖刺激胰島素分泌試驗(yàn)

缺氧培養(yǎng)12 h后，收集胰島進(jìn)行葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)。每組隨機(jī)選取10個胰島置于含2.8 mmol/L葡萄糖的克-林二氏重碳酸鹽緩沖液（Krebs-Ringerbicarbonate buffer，KRBH）中預(yù)孵育30 min。預(yù)孵育后，將胰島分別在含糖2.8 mmol/L（低）和16.8 mmol/L（高）葡萄糖的KRBH中孵育1 h。收集上清液，采用小鼠超敏胰島素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（10-1249-01，瑞典Mercodia公司）測定各個樣品中胰島素濃度。刺激指數(shù)（stimulation index，SI）按以下公式計算：SI=高糖刺激下胰島分泌的胰島素/低糖環(huán)境下胰島分泌的胰島素。

1.6 胰島細(xì)胞核因子相關(guān)因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白表達(dá)檢測

Western blotting檢測胰島細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的水平。探討加入hAME培養(yǎng)的胰島細(xì)胞，相較于不加入hAME培養(yǎng)的胰島細(xì)胞，在缺氧和正常培養(yǎng)環(huán)境下抵抗氧化應(yīng)激的能力是否增強(qiáng)。

1.7 小鼠腎被膜下胰島移植

1.7.1 糖尿病小鼠模型的誘導(dǎo)及分組進(jìn)行移植：采用鏈脲佐菌素（S0130，美國Sigma公司）誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型。將糖尿病小鼠隨機(jī)分為4組，分別為缺氧培養(yǎng)對照組（n=10）、缺氧培養(yǎng)+hAME實(shí)驗(yàn)組（n=10）、假手術(shù)組（Sham組，n=6）、正常對照組（Naive組，n=6）。在體外培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)挑選200個胰島移植到受體小鼠腎被膜下。假手術(shù)組和正常對照組用于與實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行比較。移植術(shù)后每3 d相同時間段測量并記錄小鼠的非禁食血糖值。連續(xù)2次測量血糖值＜11.1 mmol/L視為糖尿病小鼠血糖恢復(fù)至正常。在觀察6周后，將受體小鼠含胰島移植物的左腎切除后，監(jiān)測非禁食血糖7 d。

1.7.2 腹腔葡萄糖耐量測試（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）：用IPGTT評估移植后小鼠體內(nèi)胰島移植物的功能，在移植術(shù)后第30天，將胰島移植后糖尿病逆轉(zhuǎn)的小鼠禁食不禁水過夜，然后腹腔注射葡萄糖（2 g/kg）。在注射后0、15、30、60、90、120 min測量血糖，繪制血糖變化趨勢曲線并計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.7.3 移植物組織病理學(xué)觀察：在移植術(shù)后第42天，切取胰島移植物，并進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片及蘇木素-伊紅（hematoxylin/eosin，HE）染色、胰島素免疫組化染色及胰島素和胰高血糖素?zé)晒怆p標(biāo)染色，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graph-Pad Prism 6軟件（GraphPad Software，lnc.，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖，所有數(shù)據(jù)以表 示。采 用One-way ANOVA、t檢驗(yàn)及Tukey’s multiple comparisons test進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAME對缺氧培養(yǎng)胰島活性的影響

經(jīng)過12 h的體外培養(yǎng)，缺氧組相較于正常氧氣培養(yǎng)組胰島活性明顯降低（P＜ 0.000 1）。與缺氧組相比，加入不同濃度（0.25～1.0 mg/mL）hAME的胰島活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），且在hAME濃度為0.75 mg/mL時對缺氧胰島的保護(hù)作用達(dá)到峰值，見圖1。

圖1 hAME提高缺氧培養(yǎng)胰島的活性Fig.1 hAME improves the activity of hypoxic cultured islets

2.2 hAME對缺氧培養(yǎng)胰島的胰島素分泌功能的影響

如圖2所示，在低糖（2.8 mmol/L）刺激下各組胰島之間的胰島素分泌量無明顯差異；在高糖（16.8 mmol/L）刺激下，缺氧對照組與hAME濃度為0.25 mg/mL時胰島的胰島素分泌量相比無明顯差異（P＞0.05）。但添加濃度為0.5、0.75及1.0 mg/mL hAME時，缺氧胰島的胰島素分泌量均明顯增多，且在hAME濃度為0.75 mg/mL時達(dá)到峰值。綜上所述，hAME在濃度為0.75 mg/mL時對缺氧胰島的保護(hù)作用最明顯，故選擇濃度為0.75 mg/mL的hAME用于后續(xù)研究。

圖2 葡萄糖刺激下的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)和刺激指數(shù)分析Fig.2 Insulin secretion experiment and stimulation index analysis under glucose stimulation

2.3 hAME對缺氧狀態(tài)下的胰島Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，缺氧培養(yǎng)組與正常氧氣培養(yǎng)組相比，胰島蛋白中Nrf2和HO-1的表達(dá)明顯增加（P＜0.000 1）。與缺氧培養(yǎng)組相比，正常氧氣培養(yǎng)+hAME組胰島蛋白中Nrf2（P＜ 0.001）和HO-1（P＜ 0.000 1）的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，正常氧氣培養(yǎng)+hAME組相比正常氧氣培養(yǎng)組，Nrf2（P＜ 0.001）和HO-1（P＜ 0.000 1）的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 Western blotting檢測胰島Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的變化Fig.3 Western blotting to detect Nrf2 and HO-1 protein expression changes in the pancreatic islets

2.4 缺氧培養(yǎng)后胰島移植治療小鼠糖尿病的效果

2.4.1 糖尿病受體小鼠非禁食血糖及體質(zhì)量監(jiān)測：為了進(jìn)一步確定缺氧培養(yǎng)后胰島移植治療小鼠糖尿病的效果，在缺氧培養(yǎng)12 h后，將等量的胰島移植到糖尿病受體小鼠腎被膜下。如圖4所示，與缺氧培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)+hAME組的血糖AUC顯著降低 ［（936.6±43.94）vs（673.4±29.53）mmol/L，P＜0.000 1］；圖4C顯示在42 d的血糖檢測期間，缺氧培養(yǎng)組和缺氧培養(yǎng)+hAME組中個體的非禁食血糖變化；圖4D小鼠體質(zhì)量監(jiān)測表明，與缺氧培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)+hAME組的小鼠體質(zhì)量明顯增高 ［AUC（383.1±10.47）vs（298.8±10.94）g/42 d，P＜ 0.000 1］。

圖4 胰島移植后糖尿病受體小鼠血糖及體質(zhì)量監(jiān)測Fig.4 Blood glucose and body weight monitoring of diabetic recipient mice after islet transplantation

2.4.2 IPGTT：缺氧培養(yǎng)+hAME組的腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)的AUC明顯低于缺氧培養(yǎng)組 ［（1 553±90.96）vs（1 836±48.78）mmol/L（120 min），P＜ 0.001］，表明缺氧培養(yǎng)+hAME組的胰島移植物比缺氧培養(yǎng)組有更好的血糖調(diào)節(jié)能力。見圖5。

圖5 腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)Fig.5 Intraperitoneal glucose tolerance test

2.4.3 胰島移植物的組織病理學(xué)染色：將受體小鼠的胰島移植物所在腎臟取出并進(jìn)行組織學(xué)染色。圖6為胰島移植物的HE染色、胰島素的免疫組織化學(xué)染色以及胰島素和胰高血糖素的免疫熒光雙標(biāo)染色的圖像。結(jié)果顯示，Hypoxia+hAME組相較于Hypoxia組胰島移植物面積更大。

圖6 胰島移植物組織學(xué)染色Fig.6 Histological islet graft staining

3 討論

胰島對缺氧十分敏感，在移植前胰腺保存、消化以及胰島純化過程中，胰島的活性和分泌功能受到缺氧影響，最終導(dǎo)致移植效果不理想。為減少缺氧造成胰島活性和功能的損傷，科學(xué)家進(jìn)行了許多研究，例如在缺氧培養(yǎng)中充入適量的CO［11］、降低培養(yǎng)時的溫度［12］、使用膠原蛋白構(gòu)建的生物支架等以改善缺氧環(huán)境中胰島的活性和功能［13］。羊膜作為一種天然的生物材料，含有豐富的生物活性分子且免疫原性低，目前被應(yīng)用于臨床燒傷和眼科疾病的治療［14-16］。研究［17］表明，hAME在胰島培養(yǎng)中作為培養(yǎng)基添加劑改善胰島活性及分泌功能。以上結(jié)果提示hAME具有細(xì)胞保護(hù)作用，并可能在胰島移植缺氧環(huán)境中充當(dāng)保護(hù)劑。此外，在胰島受到氧化應(yīng)激損傷時，Nrf2作為抗氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子［18］，可通過誘導(dǎo)HO-1表達(dá)來應(yīng)對氧化應(yīng)激和炎癥［19］。有研究［10］表明hAME通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路來保護(hù)H9c2細(xì)胞免受低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，因此，筆者推斷hAME對缺氧狀態(tài)下胰島的保護(hù)作用可能涉及Nrf2/HO-1通路。在本研究中，添加hAME可以在缺氧狀態(tài)下明顯改善胰島活力和胰島素分泌功能，同時增加了缺氧狀態(tài)胰島細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1的表達(dá)，這與之前的推斷一致。在42 d的移植觀察期內(nèi)，與對照組相比，加入hAME的實(shí)驗(yàn)組胰島移植效果有顯著改善，這表明在缺氧環(huán)境下加入hAME培養(yǎng)的胰島具有更高的活性和調(diào)節(jié)血糖的能力。本研究對hAME于缺氧狀態(tài)下胰島的活性及分泌功能的保護(hù)作用進(jìn)行了初步研究，不良反應(yīng)和hAME的具體成分有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究證明hAME可改善缺氧狀態(tài)下胰島的活性及葡萄糖刺激胰島素分泌功能，提高缺氧培養(yǎng)胰島細(xì)胞內(nèi)Nrf2/HO-1蛋白的表達(dá)，同時改善胰島移植物的功能。hAME是一種天然的生物材料，富含生物活性分子及細(xì)胞外基質(zhì)成分，且易獲取，有望作為胰島缺氧保護(hù)劑應(yīng)用于胰島移植中。