楊潤芬， 楊力權， 劉紅艷， 李 蕾， 李馨偉， 桑 鵬， 尹以瑞

（大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

尿酸為三氧基嘌呤（C5H4N4O3)，是生物體嘌呤代謝的產(chǎn)物，微溶于水，易形成晶體，過高的血尿酸濃度對機體來說是有害的， 尿酸代謝不平衡會導致痛風、 腎結(jié)石和血管類等疾病 （孫澤銳等，2021) 。 尿酸氧化酶作為生物體內(nèi)嘌呤降解代謝途徑的關鍵酶， 能催化尿酸氧化為尿囊素和過氧化氫。 許多生物，如狒狒、豬等，都能利用尿酸氧化酶將其分解為易溶于水的尿囊素（熊潤松等，2012），尿囊素在體內(nèi)具有良好的溶解性， 溶解度是尿酸（0.5 mmol/L，37 ℃） 的 5 ~ 10 倍， 約為 5 mmol/L（37 ℃），不發(fā)生積累而直接排出體外（Bosly 等，2003；章茹等，1997）。

尿酸氧化酶在自然界廣泛存在，動物、植物、真菌和細菌中均有發(fā)現(xiàn)（張金龍等，2010；劉勁等，2008）。 目前上市的尿酸氧化酶藥物有豬-狒狒尿酸氧化酶嵌合體和重組黃曲霉尿酸氧化酶兩種， 而國內(nèi)還鮮見有進入臨床的尿酸氧化酶類藥（張榮欣等，2008）。 有研究表明，微生物如鼠李糖乳酸桿菌（L.rhamnosus）經(jīng)過誘導后具有較強的尿酸降解能力（黃琳秋等，2016），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）基因組中含有尿酸氧化酶基因（張曉暉，2019；白運煥等，2018）。 其中， 微生物來源的尿酸氧化酶如Aspergillus flavus （葉澤，2019） 和 Bacillus fastidiosus（Roda等，2006），活性均在 10 U/mg 以上，而來自豆類植物的尿酸氧化酶活性為2 ~ 6 U/mg （ Montalbini 等，1999），來自哺乳動物的尿酸氧化酶如豬和狒狒的活性分別為5 U/mg 和1 U/mg（陳勁春等，2015；Kelly 等，2001）。 微生物來源的尿酸氧化酶活性明顯高于其他來源，因此，微生物成為了新的尿酸氧化酶的重要來源。

本研究以云南大理洱海底泥為試驗材料，經(jīng)過富集培養(yǎng)、篩選分離出尿酸降解菌，并對所獲得的一株尿酸降解菌進行發(fā)酵培養(yǎng)， 獲得胞內(nèi)的酶進行酶學性質(zhì)研究， 旨在為今后洱海尿酸氧化酶的研究和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本次試驗樣品來自大理洱海，在采樣點 （N25°36′ ~ 25°58 ′，E100°06′ ~ 100°18′）采集20 g 底泥作為試驗材料。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基 尿酸基礎培養(yǎng)基（g/L）：MgSO40.5，NaCl 0.1，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO20.5，尿酸2，pH 7.0；固體分離培養(yǎng)基添加 2% 的瓊脂。

產(chǎn)尿酸氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，蔗 糖 20，NaCl 0.5，MgSO41，KH2PO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，尿酸 1.5，pH 7.0。

1.2.2 試驗儀器 電子分析天平、 高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；艾柯超純水生成儀、紫外可見光分光光度計（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器公司）；SPX-250B-D 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 （上海一恒科學儀器有限公司）；Eppendorf PCR 儀、BIORAD 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 產(chǎn)尿酸氧化酶菌株的富集與篩選 取10 g洱海底泥樣品，加入到尿酸基礎培養(yǎng)基中，振蕩富集培養(yǎng)3 d。 梯度稀釋分別做5 個稀釋梯度，分別稀釋 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5后涂布于含有尿酸基礎培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選單菌落，轉(zhuǎn)接到尿酸氧化酶發(fā)酵平板中進一步純化， 獲得一株純培養(yǎng)菌株保存于甘油管凍存，待用。

1.3.2 菌株生長和胞內(nèi)、 胞外尿酸氧化酶活性檢測 挑取上述產(chǎn)尿酸氧化酶菌株單菌落接種于200 mL 的尿酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)， 每隔12 h 取發(fā)酵液檢測菌體濃度（OD600nm）和發(fā)酵液中尿酸的殘余量（OD290nm）。 每次檢測取1 mL 發(fā)酵液用于測菌體濃度， 取50 mL發(fā)酵液8000 g，室溫離心20 min 取上清發(fā)酵液為胞外酶，并測發(fā)酵液尿酸含量，收集菌體加50 mL PBS 緩沖液（pH 8.0）懸浮后超聲波破碎 20 min，裂解液在4 ℃、12000 g，離心 20 min，取裂解上清液為胞內(nèi)酶。 以濃度為0.06 mmol/L 的尿酸為底物，加入50 μL 粗酶液，反應 15 min 后使用紫外光分光光度計測定OD290nm吸光值。酶活力計算公式如下：

1.3.3 產(chǎn)酶菌株16S rRNA 基因測序及鑒定 收集尿酸降解菌純培養(yǎng)菌體，根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行DNA 的提取。 使用通用引物 27F：5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R：5 ’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’擴增細菌 16S rDNA。PCR 擴增條件為：預變性 94 ℃，4 min；變性 94 ℃，30 s；退火55 ℃，35 s；延伸 72 ℃，90 s；32 個循環(huán)后，最后延伸 72 ℃，5 min。 PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 使用膠回收試劑盒進行PCR 產(chǎn)物回收。 將PCR 回收產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限責任公司進行測序， 測序結(jié)果上傳至 GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）， 并在 BLAST 數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行比對， 根據(jù)細菌 16S rRNA 基因序列相似性， 利用MEGA 7.1 軟件進行系統(tǒng)進化分析。

1.3.4 最適反應溫度的測定 以0.06 mmol/L 的尿酸為底物，加 50 μL 粗酶液，分別在 20、25、30、35、40、45、50、55 ℃下測該酶的活性，每組試驗設置 3個平行試驗組，一個對照組（加入100 ℃高溫酶活酶），反應15 min 后分別測定在OD290nm的吸光度值。

1.3.5 最適反應pH 用不同的pH 緩沖液（pH 3~8 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 8 ~ 9 甘氨酸-NaOH 緩沖液） 溶解尿酸至濃度為0.06 mmol/L，在最適溫度下反應15 min 后，測OD290nm的吸光度值。

1.3.6 溫度和pH 對粗酶液穩(wěn)定性的影響 將1 mL粗酶液分別置于不同的溫度（30、35、40 ℃）下保溫， 在保溫 20、40、60、80、100、120 min 時測定酶活。以保溫0 min 溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比， 并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線。每組試驗設置3 個平行。

取適量0.5 mL 粗酶液分別加入1.5 mL 不同pH 緩沖液（pH 3 ~ 10）孵育 12 h 或 24 h 后作為反應的酶液加入反應體系中， 以生理鹽水（0.9%NaCl）稀釋的粗酶液作為對照組。在最適溫度下反應15 min，測吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 菌株生長與發(fā)酵液中尿酸的降解 在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DLEH-68 的生長情況（OD600nm）和對尿酸的降解情況（OD290nm）如圖1 所示。 結(jié)果表明，隨著菌體量增加，尿酸逐漸被降解；培養(yǎng)前36 h 菌株DLEH-68 處于對數(shù)生長期， 尿酸含量迅速下降；至48 h 時，菌株進入穩(wěn)定期，尿酸含量趨于穩(wěn)定。 這說明菌株DLEH-68 能產(chǎn)生尿酸降解相關酶，利用尿酸提供生長所需碳源和氮源。

圖1 菌體生長與尿酸降解

2.2 胞內(nèi)、 胞外尿酸氧化酶活性測定 如圖2 所示，胞內(nèi)的活性無論在各個培養(yǎng)時間段（12~48 h）都高于胞外，胞內(nèi)的活性在培養(yǎng)12 h 時最高，由此確定該菌株所產(chǎn)尿酸氧化酶以胞內(nèi)酶為主，12 h時活性達到最高。

圖2 不同培養(yǎng)時間胞內(nèi)和胞外尿酸氧化酶活性

2.3 菌株DLEH-68 分子生物學鑒定 通過16S rRNA 序列通用引物PCR 和測序， 獲得1437 bp 16S rRNA 基因核苷酸序列， 序列在線上傳至GenBank， 登錄號：NO.MW090727， 與菌株 Klebsiella oxytoca N8 （登錄號：KM349413.1）親緣關系最近，同源性為 99.65%（圖 3），基于 16S rRNA 序列同源性構建系統(tǒng)進化樹， 菌株DLEH-68 與Klebsiella 屬聚在一枝，故通過分子生物學鑒定該菌株為克雷伯氏菌屬菌株， 命名為Klebsiella sp.DLEH-68。

圖3 基于16S rRNA 序列同源性構建菌株DLEH-68 的系統(tǒng)進化樹

2.4 最適溫度和pH 如圖4a 所示， 菌株DLEH-68 來源尿酸氧化酶的最適溫度為35 ℃。 在20 ℃時基本無活性，隨著溫度升高活性漸漸的增長，在35 ℃時達到最高， 隨后逐漸降低直至55 ℃徹底失去活性。 如圖4b 所示，其最適反應pH 為7.0，在pH 3.6 開始有活性，越接近中性pH 活性越高，在pH 7.0 時達到最高，pH>7.0，活性逐漸降低，在pH 6.6 ~ 7.6 保持60%以上。

圖4 溫度（a）和 pH（b）對菌株 DLEH-68來源尿酸氧化酶活性的影響

2.5 溫度對酶穩(wěn)定性的影響 在30、35、40 ℃三個溫度下熱處理， 結(jié)果如圖5 所示，35 ℃下處理20 min 后達到最高， 隨著熱處理時間的延長，活性逐漸降低，在處理80 min 時降低至60%并處于穩(wěn)定至100 min， 在處理120 min 后急劇下降至13%。 在溫度為30 ℃和40 ℃下熱處理酶喪失活性的速度較快， 在處理60 min 后均下降至75%，隨著處理時間的延長，40 ℃下下降的最快，30 ℃下降速率較慢，當處理120 min 后降至30%。

圖5 溫度對菌株DLEH-68來源尿酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

2.6 pH 對酶穩(wěn)定性的影響 菌株DLEH-68 來源尿酸氧化酶分別在pH 3 ~ 10 中處理12 h 和24 h，結(jié)果如圖 6 所示。 在處理 12 h 后，該酶從pH 3 開始有活性，pH 越接近中性活性越高，并在中性pH 7 時達到最大， 有最初的43%升高到92%， 之后隨 pH 從 7 升高到 10， 酶活性逐漸降低，在 pH 10 時降至 40%。 在處理 24 h 后，pH 3、pH 3.6 均沒有活性，從pH 4 開始有35%的活性，也是隨著pH 越接近于中性，酶活性越高，但都低于處理12 h 的活性。 在pH 7 ~ 10， 活性逐漸降低，當pH 到10 時活性降到14%。

圖6 pH 對菌株DLEH-68來源尿酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

3 討論

尿酸氧化酶作為治療高尿酸癥的最有發(fā)展優(yōu)勢和最具有潛力的一類藥， 越來越受到人們的重視和關注， 而微生物具有易于培養(yǎng)和代謝類型多樣的特點。由此產(chǎn)生很多對人類有益的代謝產(chǎn)物，是尿酸氧化酶的一個重要來源，為現(xiàn)代醫(yī)藥的發(fā)展做出了重大貢獻。 對現(xiàn)有微生物資源進行高通量篩選， 有可能找到性能上更適合醫(yī)藥應用的酶（咸靜女等，2018；張玉然等，2016）。 近年來不斷有研究在挖掘和探究產(chǎn)尿酸氧化酶的細菌、真菌，目前已知的產(chǎn)尿酸氧化酶微生物有產(chǎn)朊假絲酵母屬，芽孢桿菌屬，曲霉屬，微桿菌屬，節(jié)桿菌屬等（ 薛璟等，2011；程新等，2009）。有報道表明Klebsiella pneumoniae 來源的尿酸氧化酶是一種新型的黃素腺嘌呤二核甘酸（FDA）依賴的尿酸氧化酶 （Hpxo）（Hicks 等，2013；Katherine等，2009）。 這預示著菌株 Klebsiella sp. DLEH-68 來源的尿酸氧化酶可能也是一種FAD 依賴的尿酸氧化酶，在檢測其活性過程中，所需FAD可能來自細胞裂解液。

本研究從洱海底泥篩選出的這株尿酸降解菌， 通過發(fā)酵發(fā)現(xiàn)其為產(chǎn)尿酸氧化酶菌株-克雷伯氏菌（Klebsiella sp. DLEH-68），對其活性進行試驗測定， 最終確定獲得的降解尿酸胞內(nèi)酶的最適pH 為7， 最適溫度為35 ℃， 處于人體體溫范圍， 對未來開發(fā)用于痛風病人的臨床診斷與注射治療有很大的潛力和研究價值。